Summary

ההשפעה של נוירונים Intracardiac על הלב אלקטרופיזיולוגיה, Arrhythmogenesis במערכת Langendorff Vivo לשעבר

Published: May 22, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של האפנון של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac, את ההערכה של השפעתה על בסיסי אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis מחנה dynamics באמצעות התקנה Langendorff ex-vivo .

Abstract

מאז ההמצאה שלו במאהה 19 מאוחר, Langendorff ex-vivo הלב זלוף המערכת ממשיכה להיות לכלי רלוונטי לומד קשת רחבה של פרמטרים פיזיולוגיים, ביוכימי, מורפולוגיים תרופתי ב לבבות denervated מרכזי. כאן, אנו מתארים הכנה של האפנון של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac והערכת השפעתה על בסיסי אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis dynamics אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה). מערכת העצבים האוטונומית intracardiac הוא מווסת על ידי ניתוח מכני פרפור השומן רפידות-גרעיני מאתר שבו ממוקמים בעיקר — או ע י השימוש הכללית, כמו גם יישוב התערבויות תרופתי. קטטר אלקטרופיזיולוגיות octapolar מוחדרים אטריום ימין של החדר הימני, ומשמשים epicardial הציב אלקטרודה מרובה מערכים (מאה) למיפוי ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע אלקטרופיזיולוגיה הלב ואת arrhythmogenesis. פורסטר תהודה העברת אנרגיה (סריג) הדמיה מתבצע ניטור בזמן אמת של רמות מחנה באזורים הלב השונים. Neuromorphology הוא למד באמצעות נוגדן מבוססי מכתים כל לבבות באמצעות סמנים עצביים כדי להדריך את זיהוי אפנון של מטרות ספציפיות של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac במחקרים שבוצעו. ההגדרה Langendorff שמחוץ מאפשר מספר רב של ניסויים לשחזור בתוך זמן קצר. למרות זאת, הטבע פתוחה חלקית של ההתקנה (למשל., במהלך המדידות MEA) מקשה על בקרת טמפרטורה קבועה, יש לשמור עד למינימום. בשיטה המתוארת זו מאפשרת לנתח, לווסת את מערכת העצבים האוטונומית intracardiac בלבבות מבוזרת.

Introduction

Langendorff ex-vivo הלב זלוף המערכת ממשיכה להיות כלי רלוונטי לביצוע קשת רחבה של פיזיולוגיים, ביוכימי, מורפולוגיים, מחקרים ב מרכזי denervated לבבות1,2 ,3,4,5 מאז ההמצאה שלו ב מאוחר 19th המאה6. נכון להיום, מערכת זו נמצאת בשימוש עדיין נרחב על נושאים שונים (למשל., פגיעה reperfusion איסכמיה) או ללמוד דום לב תרופתי אפקטים7,8, הוא כלי בסיסי מחקר הלב וכלי הדם. תוחלת החיים של שיטה זו היא תוצאה של מספר יתרונות (למשל., מדידות מבוצעות ללא השפעת מערכת העצבים המרכזית או אחרים איברים, מחזור מערכתי, או במחזור הורמונים). אם יש צורך, תרופות ושניתן להוסיף בצורה מבוקרת את המאגר זלוף או חלה על מבנים ספציפיים ישירות. ניסויים לשחזור, מספר גבוה יחסית של ניסויים יכול להתבצע תוך תקופה קצרה של זמן. אופי פתוח (באופן חלקי) ההתקנה יכול להפוך לוויסות טמפרטורת קשה ואני צריכה להילקח בחשבון. למרות שהמערכת Langendorff משמש גם מינים גדולים יותר9, חיות קטנות יותר משמשות בעיקר הגדרת הניסוי הוא פחות מורכב, השתנות ביולוגי גדול יותר (למשל., הטרנסגניים העכבר מודלים) יכול לשמש.

בכיוונון ניסיוני של פרוטוקול זה, היא ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac על פרמטרים בסיסיים אלקטרופיזיולוגיות, arrhythmogenesis חדרית, הולכה epicardial dynamics אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה) הערכה. מספר גדול של הגרעינים intracardiac, אשר ממוקמים בעיקר רפידות השמן פרפור, ידועים כעת לשליטה עצמאית של בקרה עצבית מרכזי הלב אלקטרופיזיולוגיה, הם שגם נשאר שלם או הוסר באופן ידני עם מכונות זהיר הקרע אפנון תרופתי של מערכת העצבים האוטונומית מתבצע באופן גלובלי על-ידי הוספת תרופות למאגר זלוף או באופן מקומי על-ידי אפנון יישוב של הגרעינים פרפור. לאחר הניסויים, הלבבות מתאימים היטב הערכה immunohistological כמו כל תאי הדם הוסר עקב זלוף מתמשך, אשר יכול להגביר את איכות מכתים.

המטרה הכוללת של טכניקות המתואר הוא להציע פרספקטיבות הרומן ללימודי מפורט לגבי ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית על הלב אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis בלב העכבר. סיבה להשתמש בטכניקה זו היא שניתן ללמוד ולשנות את מערכת העצבים האוטונומית ללא ההשפעה של מערכת העצבים המרכזית. אחד היתרונות העיקריים להעסקת קל ניסויים תרופתי, במאפייני איזה פוטנציאל pro – או תרופות ישנות, סוכנים חדשים יכול להיבדק. בנוסף, העכבר הטרנסגניים נוקאאוט מודלים של מחלות לב שונות זמינים לחקור את המנגנונים שבבסיס הפרעות קצב, אי ספיקת לב או מחלות מטבוליות. גישה זו יש משופרת הבנתנו כיצד מערכת העצבים האוטונומית על רמת פרוזדורים יכולים להשפיע אלקטרופיזיולוגיה לב חדרית ומעגל של הפרעות בקצב הלב.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על-ידי הרשויות המקומיות של המדינה של המבורג, טיפול בבעלי חיים אוניברסיטת המבורג שימוש ועדות. 1. הכנת המנגנון Langendorff הערה: מערכת זמינים מסחרית זלוף Langendorff משמש. להכין פתרון קרבס-Henseleit שונה (119 מ מ של נתרן כלורי, 25 מ מ של סודיום ב?…

Representative Results

איור 1 מציג תמונה של ההתקנה Langendorff כולל 2 מערכים רב אלקטרודה (אותי). לפני הניסוי, הקטטר intracardiac ממוקם קרוב הצינורית כדי להקל על הכניסה מהיר וקל בחלל האטריום/ממש ולהבטיח פרק זמן קצר עד equilibration יכולה להתחיל. החלק התחתון של החדר יכול להיות מוגבר כאן (ראו החיצים <str…

Discussion

כתב יד זה, Langendorff ידועים שמחוץ הלב זלוף המערכת מוצג ככלי לחקור את ההשפעה של נוירונים intracardiac על הלב אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis באמצעות מיפוי השונות וטכניקות גירוי כולל גישות endocardial epicardial.

בכמה חלקים של הפרוטוקול מכריעים עבור ההתקנה. ראשית, חשוב להשתמש בטכניקה הכנה בה רפ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות Hartwig Wieboldt שלו סיוע טכני מעולה, דוק מיקרוסקופ הדמיה המתקן (Umif) של אוניברסיטת רפואי במרכז המבורג-גלאים עבור מיקרוסקופים ותמיכה. מחקר זה היה לפי ממומן Förderverein des Universitären Herzzentrums המבורג e.V. ועל ידי את DZHK (גרמנית מרכז למחקר קרדיו) [FKZ 81Z4710141].

Materials

Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014 Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonate Sigma-Aldrich 401676 Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M1880 Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 Modified Krebs-Henleit solution
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtra Sigma-Aldrich P8574 Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2) SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany Modified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22 EMD Millipore SCGPT05RE Modified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfate Sigma-Aldrich A0257 Neuromodulation
Hexamethonium chloride Sigma-Aldrich H2138 Neuromodulation
Nicotine free base 98-100% Sigma-Aldrich N3876 Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128 Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich 252859 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco / Invitrogen 18912-014 Whole mount staining
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787 Whole mount staining
Albumin bovine fraction V Biomol, Hamburg, Germany 11924.03 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG R&D Systems AP182B Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igG R&D Systems AP192P Whole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igY R&D Systems BAD010 Whole mount staining
Vectashield mounting medium Vector laboratories, Burlingame, CA, USA H-1000 Immunohistochemistry
Vectastain ABC kit Vector laboratories, Burlingame, CA, USA PK-4000 Immunohistochemistry
Steady DAB/Plus Abcam plc, Cambridge, UK ab103723 Whole mount staining
HistoClear DiaTec, Bamberg, Germany HS2002 Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting medium Vector laboratories, Burlingame, CA, USA VEC-H-1400 Immunohistochemistry
Perfusion system HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany  73-4343 Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand PL3508 PowerLab 8/35 Langendorff setup
Octapolar catheter CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA custom Langendorff setup
Stimulus generator STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany STG4002-160µA Stimulation setup
Stimulation software Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany MC_Stimulus II Stimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany USB-ME128-System MEA setup
Multi-electrode array MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany EcoFlexMEA36 MEA setup
Multi-electrode array recording software Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany MC_Rack MEA setup
Spring scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 15003-08 Heart Preparation
Strabismus Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14575-09 Heart Preparation
Mayo Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14110-15 Heart Preparation
Dumont SS Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11203-25 Heart Preparation
London Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11080-02 Heart Preparation
Narrow Pattern Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11003-13 Heart Preparation
Plastic Wrap Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States Consumable Materials
Stereomicroscope Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany FRET
LED CoolLED, Andover, UK pE-100 FRET
DualView Photometrics, Tucson, AZ, USA DV2-SYS FRET
DualView filter set Photometrics, Tucson, AZ, USA 05-EM FRET
optiMOS scientific CMOS camera Qimaging, Surrey, BC, Canada 01-OPTIMOS-R-M-16-C FRET
Imaging software   Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA FRET
Analysis Software Image J software; Public Domain, NIH, USA FRET

References

  1. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
  2. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  3. Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
  4. Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
  5. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
  6. Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
  7. Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
  8. Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  9. Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
  10. Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
  11. Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
  12. Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
  13. Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
  14. Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
  15. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  16. Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
  17. Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
  18. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  19. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
  20. Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
  21. Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
  22. Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
  23. Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).
check_url/cn/57617?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Jungen, C., Scherschel, K., Bork, N. I., Kuklik, P., Eickholt, C., Kniep, H., Klatt, N., Willems, S., Nikolaev, V. O., Meyer, C. Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System. J. Vis. Exp. (135), e57617, doi:10.3791/57617 (2018).

View Video