Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección
Summary
Enfoques basados en proteína fluorescentes para monitorear efectores secretados por las bacterias en las células del huésped son desafiantes. Esto es debido a la incompatibilidad entre proteínas fluorescentes y el sistema de secreción tipo III. Aquí, un optimizado superfolder GFP sistema se utiliza para la visualización de efectores secretados por las bacterias en la célula de la planta huésped.
Abstract
Las bacterias, uno de los más importantes agentes causantes de varias enfermedades de planta, secretan una serie de proteínas efectoras dentro de la célula de la planta de host para subvertir el sistema de inmunológico de la planta. Durante la infección los efectores citoplásmicos se entregan al citosol anfitrión vía un tipo sistema de la secreción de III (T3SS). Después de la entrega en la célula de la planta, el effector(s) apunta a la compartment(s) específicos para modular los procesos de la célula huésped para la supervivencia y replicación del patógeno. Aunque ha habido algunas investigaciones sobre la localización subcelular de proteínas efectoras de las células hospedadoras para entender la función de patogenicidad mediante el uso de proteínas fluorescentes, investigación de la dinámica de efectores inyectados directamente de las bacterias ha sido un desafío debido a la incompatibilidad entre el T3SS y proteínas fluorescentes.
Aquí, describimos nuestro método reciente de un sistema de la proteína verde fluorescente de superfolder de split optimizado (sfGFPOPT) para visualizar la localización de efectores entregados vía el T3SS bacteriana de la célula huésped. El sfGFP11 (11 ath β-filamento de sfGFP)-etiquetado efectoras secretadas a través del T3SS se pueden montar con un orgánulo específico dirigido 10 sfGFP1OPT (1-10th β-filamento de sfGFP) líder para la emisión de fluorescencia en el sitio. Este protocolo proporciona un procedimiento para visualizar la señal de fluorescencia sfGFP reconstituido con una proteína efectora de Pseudomonas syringae en un orgánulo especial en las plantas de Arabidopsis y Nicotiana benthamiana .
Introduction
Las plantas son organismos sésiles que encuentran numerosos patógenos invasores como bacterias, hongos, virus, insectos y nematodos en todo su ciclo de vida. Entre los fitopatógenos, las bacterias patógenas Gram negativas como Pseudomonas spp. y Ralstonia spp., infecta sus plantas hospederas ingresando a través de heridas o aberturas naturales como las estomas y los hidatodos1. Colonizar con éxito plantas huésped, patógenos bacterianos han evolucionado para desarrollar una variedad de factores de virulencia2. Cuando las bacterias invaden una planta del anfitrión, inyectan una serie de proteínas de virulencia — conocidas como efectores, directamente en las células de la planta para promover su patogenicidad. Estos efectores suprimen o modulan la inmunidad innata de la planta y manipulan los procesos celulares del anfitrión para dar lugar a supervivencia bacteriana3.
Bacterias patógenas principalmente usan un T3SS para proporcionar proteínas efectoras directamente a host células4. El T3SS se asemeja a una jeringa molecular con un canal de aguja-como conectar desde una estructura de la proteína del andamio en el interior y el exteriores membranas bacterianas para el sitio de la inyección del anfitrión célula5. Este mecanismo de secreción de T3SS mediada por efectores (T3E) está bien conservado en varios patógenos bacterianos Gram negativos de la planta como humano. Uno de los patógenos de plantas representativas, la p. syringae pv. Tomate DC3000 CCDH mutante, que tiene típicamente una T3SS defectuoso, ha restringido el crecimiento de las plantas probablemente debido a la incapacidad de este mutante para suprimir completamente la planta inmunidad (mediante la inyección de proteínas efectoras)6. Sobre desplazamiento en las células hospedadoras, efectores dirigidos a diversas proteínas del huésped que son importantes para el sistema de célula de host, incluyendo respuestas de defensa de la planta, transcripción genética, muerte celular, proteasoma, tráfico de vesículas y hormona vías7 , 8 , 9 , 10. por lo tanto, el seguimiento de la localización celular de las proteínas efectoras de las células hospedadoras es un objetivo atractivo para comprender sus funciones con respecto a la modulación de la inmunidad de la planta.
La mayoría de los estudios de localización de la T3Es ha empleado Agrobacterium-mediada por sobreexpresión de una proteína grande de la fluorescencia en el host planta9. Sin embargo, el método de expresión heteróloga de genes que se introducen en otras especies se ha demostrado para ser mal localizado o en ocasiones no funcional11,12,13. Además, varios estudios revelaron que efectores bacterianas sufren modificación para apuntar correctamente en el host células14,15,16,17. Por lo tanto, transitorio expresó efectores en el citosol de la planta las células no pueden ser funcionalmente o cuantitativamente idénticas a los efectores que son entregados por el T3SS al patógeno infección18. Por otra parte, la fusión de grandes etiquetas fluorescentes a proteínas efectoras puede interrumpir la efectora adecuada entrega y visualización18,19. Por lo tanto, estos enfoques para analizar la función T3E no pueden reflejar plenamente la localización nativa de los efectores secretados de T3SS.
Una proteína fluorescente verde (GFP) se compone de un cadena de 11 β-barril que encierra un filamento central que incluye un cromóforo20. Waldo et al. informó un sistema split-GFP novela que consta de un pequeño componente (GFP β strand 11; GFP11) y un gran fragmento complementario (GFP β el filamento 1-10; GFP1-10)21. Los fragmentos no es fluorescente por sí mismos pero es fluorescente sobre su autoasociación cuando ambos fragmentos están muy cerca entre sí. Para la optimización de la eficiencia de proteína plegable robustas plegables variantes de la GFP, es decir, sfGFP y sfGFPOPT, posteriormente fueron desarrollados para el split GFP sistema20,21,22. Recientemente, solo aminoácido mutado variantes de sfGFP1-10OPT– sfYFP1-10OPT y sfCFP1-10OPT– que puede reconstituir con un fragmento de sfGFP11 y mostrar fluorescencia de color amarillo y cian, respectivamente, fueron generados23 . Por otra parte, sfCherry, un derivado de mCherry, puede ser dividida en fragmentos de 10 sfCherry1 y sfCherry11 de la misma manera que sfGFP23.
Este sistema ha sido adaptado para etiquetar y rastrear los efectores T3SS en células HeLa durante la infección con los efectores de Salmonella24. Sin embargo, que fue previamente no optimizado para el sistema planta-bacteriano patógeno. Recientemente, hemos optimizado el sistema GFP de split basado en el sfGFP1-10 mejoradoOPT para monitorear la localización subcelular de la T3Es entregada de p. syringae en plantas células25. Para facilitar los estudios de localización de T3Es a diferentes compartimentos subcelulares en las células de la planta, un conjunto de transgénicas de Arabidopsis thaliana se generaron plantas para expresar sfGFP1-10OPT en los distintos compartimientos subcelulares 25. Además, la plásmidos llevan una variedad de organelas-destinados a la sfGFP1-10OPT Agrobacterium-sobreexpresión transitoria mediada y los vectores con etiquetas sfGFP11 para la entrega de la base de T3SS efectoras se generaron también. Las semillas de varias líneas transgénicas de Arabidopsis y la plásmidos expresar T3Es de interés pueden obtenerse de fuentes mencionadas en la Tabla de materiales26,27.
En el siguiente protocolo, describimos un sistema optimizado para monitorear la dinámica de los efectores por las bacterias en las células hospedadoras mediante el sistema de sfGFP de split. La infección de plantas que expresan sfGFP1-10OPT con transgénicos Pseudomonas llevando el plásmido recombinante sfGFP11 resulta en una entrega del efector tagged sfGFP11 de Pseudomonas en la célula huésped. En consecuencia, estas proteínas se reconstituyen y translocan a la compartment(s) objetivo de efectores específicos. La Pseudomonas syringae pv. tomate CUCPB5500 cepa en la que 18 efectores se eliminan, se utilizó debido a que esta cepa mostró baja o no la muerte celular en a. thaliana y N. benthamianas28. Sin embargo, todos los materiales y pasos que se describen aquí pueden ser reemplazados o modificados para adaptar el sistema de sfGFP División de investigación de otras cuestiones biológicas o de optimización en las condiciones de laboratorio dado.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo aquí descrito se utiliza para monitorear la localización exacta de las proteínas efectoras inyectadas por el T3SS bacteriana en la célula de planta huésped a la infección. Anteriormente, el sistema GFP de split fue utilizado como una herramienta para el estudio de la localización subcelular de las proteínas mamíferas23,36 salmonelas T3E localización y Agrobacterium VirE2 entrega a través de la T4SS en la planta células<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planificación futura (NRF-2018R1A2A1A05019892) para DC y por una beca del centro de crianza de planta Molecular ( PMBC) del siguiente generación Biogreen 21 programa de la dirección de Desarrollo Rural (PJ013201) a EP Agradecemos al centro de proyección de imagen del Centro Nacional de instrumentación para la gestión ambiental proporcionar un microscopio confocal para el rodaje.
Materials
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP | |
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