Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce
Summary
Sfidando i neuroni giovani in nuove regioni del cervello possa rivelare importanti intuizioni come l’ambiente scolpisce maturazione e destino neuronale. Questo protocollo descrive una procedura per raccogliere precursori Interneurone da regioni specifiche del cervello e trapiantarli o homotopically o heterotopically nel cervello dei cuccioli postnatali.
Abstract
Maturazione e la determinazione di destino neuronale richiede un gioco intricato tra programmi genetici e segnali ambientali. Tuttavia, districare i ruoli di intrinseca vs estrinseche meccanismi che regolano questo processo di differenziazione è un enigma per tutti i neurobiologi inerente allo sviluppo. Questo problema è amplificato per interneuroni GABAergici, una popolazione incredibilmente eterogenee delle cellule che è nato da strutture embrionali transitorie e sottoposti a una prolungata fase migratoria per disperdere tutto il telencefalo. Per esplorare come i diversi ambienti di cervello influenzano interneurone destino e maturazione, abbiamo sviluppato un protocollo per la raccolta dei precursori Interneurone immaturo fluorescente contrassegnati da regioni specifiche del cervello in topi neonati (P0-P2). A questa età, migrazione Interneurone è quasi completa e queste cellule risiedono nei loro ambienti di riposo finale con relativamente poca integrazione sinaptica. Dopo il prelievo delle soluzioni di singola cellula tramite citometria a flusso, questi precursori Interneurone sono trapiantati in P0-P2 wildtype postnatali cuccioli. Eseguendo entrambi omotope (per esempio, corteccia di corteccia) o eterotopica (ad es., corteccia di ippocampo) trapianti, si può valutare come impegnativo immaturi interneuroni in nuovi ambienti di cervello colpisce il loro destino, la maturazione e l’integrazione di circuito. Cervelli possono essere raccolte in topi adulti e analizzati con una vasta gamma di analisi posthoc su cellule innestate, compreso immunohistochemical, elettrofisiologici e transcriptional profiling. Questo approccio generale fornisce gli investigatori con una strategia di test come distinti ambienti di cervello possono influenzare numerosi aspetti dello sviluppo del neurone e identificare se caratteristiche specifiche di un neurone sono principalmente guidate da programmi genetici hardwired o stimoli ambientali.
Introduction
La funzione corticale appropriata richiede un equilibrio tra neuroni di proiezione eccitatori e inibitori GABAergici, una popolazione estremamente eterogenea con morfologie distinte, proprietà elettrofisiologiche, connettività e neurochimici marcatori. Sviluppo anormale e funzione di interneuroni (e sottogruppi specifici Interneurone) è stato collegato a pathobiology di disturbi psichiatrici come la schizofrenia, autismo ed epilessia1,2,3. Inoltre, molti geni implicati in questi disordini del cervello sono fortemente arricchiti in interneuroni giovane4. Così, una maggiore comprensione dei meccanismi che regolano la maturazione e la determinazione di destino Interneurone è necessaria per comprendere lo sviluppo normale e potenziali eziologie delle numerose malattie del cervello.
Interneuroni del forebrain nascono principalmente da due strutture embrionali transitorie, le eminenze gangliare mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente). Queste cellule postmitotic (precursori Interneurone) quindi subire una fase prolungata migrazione tangenziale per disperdere tutto il telencefalo dove si integrano in una vasta gamma di circuiti. Interneuroni MGE-derivati sono costituiti da tre sottogruppi in gran parte non sovrapposte, neurochemically definiti: veloce chiodare interneuroni parvalbumina (PV+), non-fast chiodare interneuroni della somatostatina (SST+) e tardi chiodare un neurone nitrico interneuroni ossido di sintetasi (nNOS+) che costituiscono le cellule hippocampal di neurogliaform ed edera. Numerosi laboratori hanno identificato parecchi meccanismi all’interno di MGE che regolano le decisioni iniziali destino in PV+ o SST + interneuroni, compresi gradienti spaziali di morfogeni, data di nascita dei precursori Interneurone e la modalità di divisione neurogena 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. è stato proposto che interneuroni inizialmente differenziano in ‘Cardinale classi’ e poi progressivamente maturano in ‘definitive classi’ come essi interagiscono con il loro ambiente11. La prova recente indica che alcuni sottotipi di Interneurone maturo possono essere geneticamente hardwired come queste cellule diventano postmitotic in eminenze gangliare, che indica che presto definiti programmi genetici intrinseci possono svolgere un ruolo più importante rispetto al passato apprezzata12,13. Tuttavia, la questione chiave di come l’intrinseci programmi genetici interagiscono con stimoli ambientali alla differenziazione di unità in sottotipi distinti Interneurone rimane in gran parte inesplorata.
Numerosi studi sono trapiantate cellule embrionali MGE direttamente in una varietà di regioni del cervello, con i risultati di consenso che innestano le cellule maturo e il rilascio di GABA per inibire generalmente il locale circuiti endogeni14,15, 16,17,18,19. Queste promettenti osservazioni hanno generato notevole interesse nell’utilizzo di cellule staminali umane pluripotenti indotte (hIPSC)-derivato interneuroni per trattare una varietà di malattie del cervello. Tuttavia, molto pochi di questi studi valutare se queste cellule innestate maturano in tipi previsti di interneuroni maturi, un componente critico quando uno pensa di approcci traslazionali.
Per affrontare come ambiente influenza la Interneurone differenziazione e maturazione, una strategia è stata ideata per trapiantare precursori immaturi Interneurone in nuovi ambienti di cervello al fine di esaminare se innestate interneuroni adottano funzionalità dell’host ambiente o conservano le caratteristiche del donatore ambiente20. MGE trapianti non sono adatti per affrontare questa domanda perché il MGE contiene una popolazione mista di Interneurone e cellule di proiezione GABAergici che disperdono nel corso di numerose regioni di cervello21. Senza sapere dove queste cellule MGE avrebbero migrato, uno non può pienamente valutare come questi trapianti sono colpiti dall’ambiente del cervello. Raccogliendo i precursori Interneurone timepoints postnatale precoce, questo problema è aggirato con l’ottenimento di cellule immature che hanno completato la loro migrazione e raggiunto la loro destinazione regione del cervello, ma hanno un’interazione minima con l’ambiente. Focalizzando l’attenzione sulle specifiche caratteristiche di interneuroni che sono differenzialmente espressi tra regioni distinte del cervello, si può quindi determinare come l’ambiente host cambia proprietà Interneurone. L’approccio generale descritto in questo protocollo dovrebbe essere applicabile a qualsiasi investigatore che vuole esaminare come i giovani neuroni si comportano quando ha sfidato in un nuovo ambiente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un aspetto critico di questo protocollo è massimizzare le possibilità di sopravvivenza delle cellule. Garantire che i tessuti e le cellule siano sempre in ghiaccio freddo carboxygenated sACSF è necessario promuovere la sopravvivenza delle cellule. Ciò richiede una strategia di dissociazione per ridurre al minimo la lunghezza del tempo che le cellule spendono in varie soluzione e all’esterno dell’ambiente di cervello e di dissezione efficiente. A seconda del numero di regioni del cervello essere sezionato e trapiantat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (K99MH104595) e il programma di ricerca intramurale NICHD a T.J.P. Ringraziamo Gord Fishell, nel cui laboratorio questo approccio originalmente è stato stabilito.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
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