והרצתי ניתוח של ליקויים מוטוריים תלויי-גיל בעכברים עם הקשורים ניוון מוחיים
Summary
במחקר זה, נדגים את השימוש קנטית והרצתי ניתוח המבוסס על הגחון המטוס הדמיה לעקוב אחר שינויים עדינים קואורדינציה, כמו גם את ההתקדמות של הקשורים ניוון מוחיים עם הגיל במודלים של העכבר (למשל, endophilin מוטציה קווים העכבר).
Abstract
התנהגות מוטורית בדיקות משמשות לקביעת הרלוונטיות פונקציונלי של מודל מכרסמים ופיתח לבחון לאחרונה טיפולים בבעלי חיים אלה. באופן ספציפי, והרצתי ניתוח מאפשרת המחלה מחדש פנוטיפים רלוונטי כי הם נצפו בחולים אנושיים, במיוחד במחלות ניווניות המשפיעות על יכולות מוטוריות כגון מחלת פרקינסון (PD), מחלת אלצהיימר (AD), מחלת ניוון שרירים טרשת נפוצה לרוחב (ALS), ואחרים. במחקרים מוקדם לאורך הקו הזה, מדידת פרמטרים הילוך היה מפרך, תלויים גורמים שהיו קשה לשלוט בה (למשל, לרוץ במהירות, ריצה רציפה). פיתוח מערכות הדמיה המטוס הגחון (VPI) עשה את זה ריאלי לביצוע ניתוח הילוך בקנה מידה גדול, הופך את שיטה זו כלי שימושי עבור ההערכה של התנהגות מוטורית בחולדות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מעמיק של אופן השימוש קנטית והרצתי ניתוח כדי לבחון את התקדמות תלויי-גיל לגירעונות מנוע העכבר דגמי הקשורים ניוון מוחיים; קווים העכבר עם רמות ירידה של endophilin, שבו ניווניות נזק בהדרגה עולה עם הגיל, משמשים כדוגמה.
Introduction
מחלות ניווניות להטיל נטל משמעותי על חולים, משפחות, ועל החברה, יהפוך לדאגה גדולה אף יותר כמו תוחלת החיים עולה, אוכלוסיית העולם ימשיך להזדקן. אחד התסמינים הנפוצים ביותר של מחלות ניווניות הן בעיות שיווי משקל וניידות. לפיכך, אפיון של התנהגות מוטורית הזדקנות יונקים (למשל, מכרסם) מודלים, ו/או מודלים מציג פנוטיפים ניווניות, הוא כלי חשוב להפגין ויוו הרלוונטיות של model(s) בעלי חיים מסוים, או טיפולית טיפולים שמטרתם לשפר את תסמיני המחלה. כמעט כל גישה לטיפול במחלות ניווניות בסופו של דבר דורשת בדיקות במודל חיה לפני תחילתן של ניסוי קליני בבני אדם. לכן, חשוב שיהיה אמין, לשחזור ההתנהגות בדיקות שניתן לכמת באופן עקבי פנוטיפים מחלות רלוונטיות לאורך התקדמות הגיל, על מנת להבטיח כי תרופה מועמד, אשר הראה פוטנציאל במודל במבחנה , יכול ביעילות להפחיתם על פנוטיפ של חיים.
היבט אחד של הערכת התנהגות מוטורית בחולדות הוא ניתוח הילוך קנטית, אשר יכול להתבצע על ידי VPI (גם צילום וידאו בשם המטוס הגחון)1,2. שיטה זו הוקמה יהפוך לרישית על הקלטה רציפה של החלק התחתון של המכרסמים הליכה על הליכון שקוף, ממונע חגורה1,2,3,4. ניתוח שידור הוידיאו הנתונים יוצר “דיגיטלי עקבות” של כל ארבעת הגפיים זה באופן דינמי ובאמינות לסכם תבנית ההליכה של מכרסם, כפי שמתואר במקור על ידי קאלה. et al. 2 ו. Amende et al. 3.
עקרון מבוססת הדמיה והרצתי ניתוח היא למדוד את השטח כפת בקשר עם החגורה הליכון לאורך זמן, על כל כף הרגל בודדים. כל תנוחת מיוצג על ידי גידול באזור כף היד (בשלב הבלימה), ירידה באזור כף היד (שלב ההינע). זה מלווה השלב המכריע שבו מזוהה אין קליטה. הנדנדה העמידה יחד יוצרים צעד. בנוסף הילוך dynamics פרמטרים, יציבה פרמטרים יכול גם להיות מופק קטעי וידאו מוקלט. הפרמטרים למופת ואת ההגדרות שלהם מפורטים בטבלה 1 , כוללים עמידה רוחב (SW; המרחק משולב כפות רגליו האחוריות או פור הציר החוטם-פלי), סטרייד פיאנו אורך (SL; המרחק הממוצע בין שני הצעדים של הכפה אותו) או כף השמה זווית (הזווית של הכפה לציר החוטם זנב). הנתונים dynamics ביציבה, בהליכה לאפשר והפקת לקחים על איזון בעלי חיים (על-ידי פרמטרים יציבה ולשינויים שלהם על פני מספר שלבים) ותיאום (על-ידי הילוך dynamics פרמטרים). פרמטרים נוספים, כגון אטקסיה מקדם (SL ההשתנות מחושב על ידי [(מקסימום. SL−min. SL) / מתכוון SL]), הגפיים האחוריות משותפים עמדה זמן (זמן זה שני הגפיים האחוריות נמצאים בקשר עם החגורה), או גרור כפת (בשטח כולל של הכפה על החגורה מתנוחת מלא כדי כף ההמראה) ניתן גם לחלץ, ואת דווחו להיות שונה ב- di ניווניות שונות sease מודלים5,–6,–7,–8 (ראה טבלה 1).
| פרמטר | יחידה | הגדרה |
| הנדנדה זמן | ms | משך זמן שהכפה אינו במגע עם החגורה |
| בזמן עמידה | ms | משך זמן שהכפה נמצא בקשר עם החגורה |
| בלם % | % מהזמן עמידה | אחוז הזמן עמידה שציפורניים הן בשלב בלם |
| % להניע | % מהזמן עמידה | אחוז הזמן עמידה שציפורניים הן בשלב הנעה |
| עמידת רוחב | ס מ | מרחק משולב קידמה או הינד הכפות לציר החוטם-פלי |
| אורך צעד | ס מ | המרחק הממוצע בין שני הצעדים של הכפה אותו |
| סטרייד פיאנו תדר | צעדים/s | מספר צעדים מלאה לשניה |
| כפת השמה זווית | מעלות | זווית הכפה ביחס הציר החוטם-הזנב של החיה |
| אטקסיה מקדם | א”א | השתנות SL מחושב על ידי ממוצע/[(max SL-min SL) SL] |
| עמידה משותפת % | אחוז עמידה | זמן תנוחת הגפיים האחוריות משותפים; פעם שני הגפיים האחוריות נמצאים בקשר עם החגורה באותו הזמן |
| כף של גרירה | מ מ2 | השטח הכולל של הכפה על החגורה מתנוחת מלא כדי כף ההמראה |
| האיבר טעינה | ס מ2 | מקס dA/dT; מקסימלי קצב השינוי של אזור כף הרגל בשלב שובר |
| שלב זווית השתנות | מעלות | סטיית התקן של הזווית בין האחוריות הכפות כפונקציה של SL ו- SW |
טבלה 1. הגדרת הפרמטרים הילוך מפתח יכול להיבדק על-ידי הדמיה המטוס הגחון.
הערכת ההתנהגות המוטורית של מכרסמים מודלים עבור מחלות ניווניות עשויה להיות מאתגרת בהתאם לחומרת פנוטיפ של דגם ספציפי בגיל נתון. מספר מחלות, בולטת PD, הצג התנהגות מנוע חזק (ומכניקה) גירעונות, הן בחולים והן במודלים של בעלי חיים. אחד 4 תסמיני המפתח ב- PD הוא bradykinesia, אשר מתקדמת עם ההזדקנות, בא לידי בליקויים חמורים הילוך כבר בשלבים המוקדמים של משטרת9. מחקרים של המודל PD חריפה, מכרסמים שטופלו 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), כבר השתמשו VPI והרצתי ניתוח10,11,12. עם זאת, בהתחשב באופי חריפה של מודל זה, מחקרים אלה אינם הכתובת ההתקדמות הקשורות לגיל של גירעונות מוטוריים. מחקרים שנעשו לאחרונה מספר ניהלו והרצתי ניתוח בעכברים בגילאי בשינויים ניווניות, לדוגמה13,14,15, תוך הדגשת הרלוונטיות של הבנת את התקדמות המחלה עם הגיל .
בנוסף גירעונות מוטוריים, מודלים חייתיים של מחלות ניווניות לעיתים קרובות יש קשיים התמקדות המשימות בדיקה, להראות ליקויים קוגניטיביים בולטים, במיוחד עם ההתקדמות בגיל. פנוטיפ כזה יכול להשפיע על התוצאה של בדיקות התנהגות מוטורית. כלומר, אחד המבחנים הנפוצה ביותר לבחון את הגירעונות מוטוריים, מבחן ‘ rotarod ‘16, מסתמך על קוגניציה, תשומת לב, מתח17,18. ואילו הנכונות כדי ללכת על הליכון ממונע תלויה גם בגורמים אלה, read-out המוקלט פועל, וזו תכונה סטנדרטית יותר, הרבה פחות מושפע קוגניציה שינו. ההשפעות של הלחץ ואת תשומת הלב עשוי להיות גלוי פרמטרים ספציפיים, כמו נדנדה/עמידה זמן דחק (סטרס) SL תשומת לב19,20, אך לא יכולת ריצה הכולל.
הגישה ניתוח הילוך קנטית נוספת מציעה את היתרון של בעל אפשרויות כדי להתאים את האתגר לדגמי מכרסמים. ההליכון עם זווית מתכווננת ומהירות מאפשר הליכה מהירויות 0.1 – 99.9 ס”מ/s, כך מכרסמים עם מגבלות הליכה קשות עדיין עשויים להיות מסוגלים לרוץ במהירות איטית (~ 10 ס”מ/s). כבדי שאינם בעלי חיים ניתן למדוד בורח מהר יותר מהירויות (30 – 40 ס”מ/s). התבוננות או לא החיות שנבדקו הם מסוגלים לרוץ במהירות מסוימת מספק תוצאה בפני עצמו. יתרה מזאת, למכרסמים ניתן לערער בנוסף לרוץ למעלה ובצדפים, או למטה ירידה, הטיית ההליכון כדי בזווית הרצויה בעזרת מד זווית, או על ידי הצמדת מזחלת משוקלל הגפיים האחוריות עכבר או חולדה.
מחקרים רבים של חלבונים יחיד הם מוטציה בחולים, יש מודעות גוברת האחרונות בקישורים בין אנדוציטוזה פגומה תהליך, הקשורים ניוון מוחיים13,21,22, 23,24,25,26,27,28. עכבר דגמים עם רמות מופחתת של endophilin-A (מעתה ואילך endophilin), שחקן מפתח שני אנדוציטוזה בתיווך clathrin13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 ו clathrin תלויית אנדוציטוזה34, נמצאו להראות הקשורים ניוון מוחיים ואת ליקויי תלויי-גיל13,פעילות גינקולוגיות21. בשלושה גנים לקודד את המשפחה של חלבונים endophilin: endophilin 1, endophilin 2, ו- endophilin 3. ראוי לציין, פנוטיפ הנובע דלדול של חלבונים endophilin משתנה מאוד בהתאם למספר של חסר endophilin הגנים13,21. בעוד טריפל הנוק-אאוט (KO) של כל הגנים endophilin הוא קטלני רק כמה שעות לאחר הלידה, ועכברים ללא שני endophilin 1 ו-2 להיכשל לשגשג ולמות בתוך 3 שבועות לאחר הלידה, קו יחיד עבור כל אחד endophilins 3 מראה אין פנוטיפ ברור עבור נבדק התנאים21. אחרים למוטציות אחרות endophilin להראות תוחלת החיים מופחתת ולפתח ליקויים מוטוריים עם העליה בגיל13. לקבלת דוגמה, endophilin 1KO-2HT-3KO עכברים התצוגה הליכה שינויים ובעיות קואורדינציה (כפי שנבדקו על-ידי קנטית והרצתי ניתוח ו- rotarod) כבר בגיל 3 חודשים של גיל, בעוד הארנבונים מאותה שלהם, endophilin 1KO-2WT-3KO חיות, התצוגה משמעותי צמצום קואורדינציה רק בגיל 15 חודשים של גיל13. בשל המגוון העצום של פנוטיפים במודלים אלה, יש צורך לזהות וליישם מבחן זה ניתן לשלב מגוון של אתגרים המתאימים המנוע של החיה, קוגניציה יכולות, כמו גם העידן. כאן, אנו מפרטים את הנוהלים ניסיוני באותיות גדולות על ניתוח הילוך קנטית כדי להעריך את התפתחות והתקדמות של ליקויים מוטוריים במודל של עכברים המציג שינויים ניווניות (קרי, מוטציות endophilin). זה כולל מדידת פרמטרים הילוך בכל הגילאים השונות severities שונות של ליקויי ומכניקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
לומד את קואורדינציה היא גישה שימושית באפיון מודלים של מחלות ניווניות, במיוחד עבור מחלות כמו משטרת שבו קואורדינציה מושפע קשות. בעזרת assay פונקציונלי ניתוח הילוך קנטית, אנו מסוגלים לזהות שינויים עדינים דהירה של בעלי חיים על תחילתה של בעיות גפיים, או בכל הדגמים עם חלש הקשורים ניוון מוחיים, פנו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים המטפלות בבעלי חיים-מתקן בעלי חיים של ENI לעזרה עם רבייה, ד ר Raimundo נונו להערות שימושי על כתב היד. I.M. נתמך על-ידי המענקים של הגרמני מחקר קרן (DFG) דרך מרכז מחקר משותף SFB-889 (פרוייקט A8) ו- SFB-1190 (פרוייקט P02), פרס החוקר הצעיר את אמי נתר (1702/1). C.M.R. נתמך על ידי המשפחה מבית הספר בוגר גטינגן עבור מדעי המח, ביופיסיקה מולקולרית החיים (GGNB).
Materials
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA | DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware | |
| non-transparent blanket or dark cloth | cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress | ||
| balance | e.g. Satorius | balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g | |
| red finger paint | e.g. Kreul or Staedtler | for increasing the contrast between paws and animal’s body | |
| small paint brush | soft brush to apply finger paint to the animal paws | ||
| diluted detergent | for cleaning | ||
| disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol | e.g. B.Braun | for desinfection |
References
- Clarke, K. A., Still, l. J. Gait analysis in the mouse. Physiology and Behavior. 66, 723-729 (1999).
- Kale, A., Amende, I., Meyer, G. P., Crabbe, J. C., Hampton, T. G. Ethanol’s effects on gait dynamics in mice investigated by ventral plane videography. Alcohol Clin Exp Res. 28 (2), 1839-1848 (2004).
- Amende, I., Kale, A., McCue, S., Glazier, S., Morgan, J. P., Hampton, T. Gait dynamics in mouse models of Parkinson’s disease and Huntington’s disease. J Neuroeng Rehabil. 25, 2-20 (2005).
- Herbin, M., Hackert, R., Gasc, J. P., Renous, S. Gait parameters of treadmill versus overground locomotion in mouse. Behavioural Brain Res. 181 (2), 173-179 (2007).
- Powell, E., Anch, A. M., Dyche, J., Bloom, C., Richtert, R. R. The splay angle: A new measure for assessing neuromuscular dysfunction in rats. Physiol Behav. 67 (5), 819-821 (1999).
- Blin, O., Ferrandez, A. M., Serratrice, G. Quantitative analysis of gait in Parkinson patients: increased variability of stride length. J Neurol Sci. 98 (1), 91-97 (1990).
- Švehlík, M. D., et al. Gait Analysis in Patients With Parkinson’s Disease Off Dopaminergic Therapy. Arch Phys Med Rehabil. 90 (11), 1880-1886 (2009).
- Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-dragging: a novel, sensitive analysis of the mouse cylinder test. J Vis Exp. (98), e52701 (2015).
- Roiz Rde, M., Cacho, E. W., Pazinatto, M. M., Reis, J. G., Cliquet, A., Barasnevicius-Quagliato, E. M. Gait analysis comparing Parkinson’s disease with healthy elderly subjects. Arg Neuropsiquiatr. 68 (1), 81-86 (2010).
- Wang, X. H., et al. Quantitative assessment of gait and neurochemical correlation in a classical murine model of Parkinson’s disease. BMC Neurosci. 13, 142 (2012).
- Lao, C. L., Kuo, Y. H., Hsieh, Y. T., Chen, J. C. Intranasal and subcutaneous administration of dopamine D3 receptor agonists functionally restores nigrostriatal dopamine in MPTP-treated mice. Neurotox Res. 24 (4), 523-531 (2013).
- Zhao, Q., Cai, D., Bai, Y. Selegiline rescues gait deficits and the loss of dopaminergic neurons in a subacute MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Int J Mol Med. 32 (4), 883-891 (2013).
- Murdoch, J. D., et al. Endophilin-A deficiency induces the FoxO3a-Fbxo32 network in the brain and causes dysregulation of autophagy and the ubiquitin-proteasome system. Cell Rep. 17 (4), 1071-1086 (2016).
- Dai, M., et al. Progression of Behavioral and CNS Deficits in a Viable Murine Model of Chronic Neuronopathic Gaucher Disease. PLoS One. 11 (9), e0162367 (2016).
- Szalardy, L., et al. Lack of age-related clinical progression in PGC-1α-deficient mice – implications for mitochondrial encephalopathies. Behav Brain Res. , 272-281 (2016).
- Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behavioural Brain Research. 141 (2), 237-249 (2003).
- Majdak, P., et al. A new mouse model of ADHD for medication development. Sci Rep. 6, 39472 (2016).
- Ishige, A., Sasaki, H., Tabira, T. Chronic stress impairs rotarod performance in rats: implications for depressive state. 行为学. (1-2), 79-84 (2002).
- Fukui, D., Kawakami, M., Matsumoto, T., Naiki, M. Stress enhances gait disturbance induced by lumbar disc degeneration in rat. European Spine Journal. 27 (1), 205-213 (2017).
- Stuart, S., Galna, B., Delicato, L. S., Lord, S., Rochester, L. Direct and indirect effects of attention and visual function on gait impairment in Parkinson’s disease: influence of task and turning. Eur J Neuroscience. 46 (1), 1703-1716 (2017).
- Milosevic, I., et al. Recruitment of endophilin to clathrin coated pit necks is required for efficient vesicle uncoating after fission. Neuron. 72 (4), 587-601 (2011).
- Shi, M., et al. Identification of glutathione S-transferase pi as a protein involved in Parkinson disease progression. Am. J. Pathol. 175 (1), 54-65 (2009).
- Arranz, A. M., et al. LRRK2 functions in synaptic vesicle endocytosis through a kinase-dependent mechanism. J. Cell Sci. 128, 541-552 (2015).
- Quadri, M., et al. Mutation in the SYNJ1 gene associated with autosomal recessive, early-onset Parkinsonism. Hum. Mutat. 34 (9), 1208-1215 (2013).
- Krebs, C. E., et al. The Sac1 domain of SYNJ1 identified mutated in a family with early-onset progressive Parkinsonism with generalized seizures. Hum. Mutat. 34 (9), 1200-1207 (2013).
- Edvardson, S., et al. A deleterious mutation in DNAJC6 encoding the neuronal-specific clathrin-uncoating co-chaperone auxilin, is associated with juvenile parkinsonism. PLoS ONE. 7 (5), e36458 (2012).
- Cao, M., Milosevic, I., Giovedi, S., De Camilli, P. Upregulation of parkin in endophilin mutant mice. J neurosci. 34 (49), 16544-16549 (2014).
- Cao, M., et al. Parkinson sac domain mutation in synaptojanin 1 impairs clathrin uncoating at synapses and triggers dystrophic changes in dopaminergic axons. Neuron. 93 (4), 882-896 (2017).
- Farsad, K., Ringstad, N., Takei, K., Floyd, S. R., Rose, K., De Camilli, P. Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin bilayer interactions. J. Cell Biol. 155, 193-200 (2001).
- Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. The SH3p4/Sh3p8/SH3p13 protein family: binding partners for synaptojanin and dynamin via a Grb2-like Src homology 3 domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (16), 8569-8574 (1997).
- Ringstad, N., et al. Endophilin/SH3p4 is required for the transition from early to late stages in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis. Neuron. 24 (1), 143-154 (1999).
- Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. J. Differential expression of endophilin 1 and 2 dimers at central nervous system synapses. Biol. Chem. 276 (44), 40424-40430 (2001).
- Verstreken, P., et al. Endophilin mutations block clathrin-mediated endocytosis but not neurotransmitter release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
- Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517, 460-465 (2015).
- Takezawa, N., Mizuno, T., Seo, K., Kondo, M., Nakagawa, M. Gait disturbances related to dysfunction of the cerebral cortex and basal ganglia. Brain Nerve. 62 (11), 1193-1202 (2010).
- Wahlsten, D. . Mouse Behavioral Testing: How to Use Mice in Behavioral Neuroscience. , (2010).
- Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. D. Treadmill Gait Analysis Does Not Detect Motor Deficits in Animal Models of Parkinson’s Disease or Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Mot Behav. 40 (6), 568-577 (2008).
- Hampton, T. G., Amende, I. Treadmill gait analysis characterizes gait alterations in Parkinson’s disease and amyotrophic lateral sclerosis mouse models. J Mot Behav. 42 (1), 1-4 (2010).
- Glajch, K. E., Fleming, S. M., Surmeier, D. J., Osten, P. Sensorimotor assessment of the unilateral 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. Behav Brain Res. 230 (2), 309-316 (2012).
- Takayanagi, N., et al. Pelvic axis-based gait analysis for ataxic mice. J Neurosci Methods. 219 (1), 162-168 (2013).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neurosci Lett. 584, 184-189 (2015).
- Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. PeerJ. 3, e1175 (2015).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C. Step Sequence is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson’s Rat Models. Cell Transplant. 26 (4), 659-667 (2017).
- Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Curr Protoc Neurosci. , (2001).
- Milosevic, I. Revisiting the Role of Clathrin-Mediated Endocytosis in Synaptic Vesicle Recycling. Front Cell Neurosci. , (2018).
