Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans
Summary
Describimos una extracción en pequeña escala modificada y análisis colorimétricos de lactato y piruvato en el nematodo elegans C.. Cuando se utilizan kits de ensayo comerciales, el desarrollo técnico de su sensibilidad y su precisión es importante. Precipitación de proteínas en la extracción es el paso más crítico para la determinación cuantitativa de los metabolitos intracelulares.
Abstract
Lactato y piruvato son intermediarios clave de vías metabólicas de energía intracelular. Monitoreo de la relación lactato/piruvato en las células ayuda a determinar si existe un desequilibrio en el metabolismo de la energía relacionada con la edad entre la fosforilación oxidativa mitocondrial y la glucólisis aeróbica. A continuación, os mostramos la utilización de kits de ensayo colorimétricos comerciales para lactato y piruvato en el organismo modelo Caenorhabditis elegans. Recientemente, la sensibilidad y la precisión de los kits de ensayo colorimétricos/fluorimétrico han mejorado grandemente por la investigación y desarrollo llevado a cabo por los fabricantes de reactivos. Los mejores reactivos han permitido el uso de ensayos en pequeña escala con una placa de 96 pocillos en C. elegans. En general, un ensayo fluorimétrico es superior en sensibilidad para un ensayo colorimétrico; sin embargo, el método colorimétrico es más conveniente para el uso en laboratorios comunes. Otra cuestión importante en estos ensayos para la determinación cuantitativa es la precipitación de la proteína de homogeneizado de C. elegans muestras. En nuestro método de precipitación de la proteína, precipitados comunes (por ej., ácido tricloroacético, ácido perclórico y ácido metafosfórico) se utilizan para la preparación de la muestra. Una muestra de ensayo libre de proteína es preparada agregando directamente Frío precipitado (concentración final de 5%) durante la homogeneización.
Introduction
Concentraciones de lactato y piruvato son consideradas ampliamente como productos intermedios del metabolismo energético y están relacionados con los Estados de la glicolisis, ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y cadena de transporte de electrones en las células de organismos aerobios. Una serie de reacciones en la glicolisis se oxida glucosa a piruvato, que se encuentra en una encrucijada metabólica y puede convertir a los carbohidratos a través de la gluconeogénesis, a ácidos grasos y el metabolismo de la energía a través de acetil-CoA y al aminoácido alanina. El ciclo TCA se produce bajo la presencia de suficiente oxígeno disuelto y es fundamental para la conversión de glucosa a energía. Sobre todo, la alteración del metabolismo secundario es un fenómeno interesante en el que la glicolisis se utiliza predominante para la producción de energía y la respiración mitocondrial aeróbica, que implica la cadena de transporte de electrones y ciclo TCA, es regulada en el cáncer de mamífero células de1,2. Hemos demostrado recientemente que los niveles de lactato y la relación consiguiente lactato/piruvato (L/P) disminuyeron durante el envejecimiento en el organismo modelo Caenorhabditis elegans (C. elegans). Asimismo, encontramos que los mamíferos tumor supresor p53 ortholog CEP-1 en C. elegans tiene un papel importante en las alteraciones relacionadas con la edad del metabolismo energético mediante la activación de sus dianas transcripcionales3.
En ensayos biológicos, tales como la medición de las concentraciones de lactato y piruvato en las células, la sensibilidad, precisión, tamaño de la muestra y tiempo de incubación de kits de ensayo colorimétricos/fluorimétrico han mejorado dramáticamente. Debido a las innovaciones tecnológicas, que ahora son capaces de analizar diversos metabolitos y metabolitos intermedios sin el cultivo a gran escala de C. elegans, que es difícil dado su pequeño tamaño. En general, la sensibilidad de un ensayo colorimétrico es un orden de magnitud más pequeño que el de un ensayo fluorimétrico; sin embargo, el método colorimétrico es más conveniente en el entorno de los laboratorios comunes. Además, una técnica de extracción con precipitación de homogeneización y proteína es crucial para la determinación cuantitativa de las concentraciones de lactato y piruvato en las células de C. elegans porque este nematodo se encuentra dentro de un exoesqueleto llama la cutícula, a diferencia de las líneas de células de mamífero cultivadas4,5. Aquí, describimos un protocolo para analizar las concentraciones de lactato y piruvato usando kits de ensayo colorimétrico comercial incluyendo consejos para extracción de muestra de C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al utilizar estos kits de ensayo colorimétricos, el paso más crítico en la extracción de la muestra para detectar celular lactato y piruvato exactamente en C. elegans es el proceso de precipitación de la proteína durante la homogeneización (figura 1). No es estrictamente necesario utilizar un homogeneizador de teflón, como otros homogeneizadores (e.g., Dounce y Rectificadoras de tejido, o molinos de grano) son también adecuados para la extracción en pequeña escal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación especial de Daito Bunka University a Sumino Yanase.
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
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