Summary

في الموقع تقنيات التهجين لعينات المرجان الكبار جزءا لا يتجزأ من البارافين

Published: August 31, 2018
doi:

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو إجراء التهجين في الموقع على عينات المرجان الكبار التي تم تضمينها في البارافين ومقطوع على الشرائح الزجاجية. هذا أسلوب نوعية المستخدمة لتصور التعبير المكاني لإجراء تحقيق معنى المضادة الحمض النووي الريبي في الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين.

Abstract

الشعاب المرجانية هي اللافقاريات المحيطات الهامة ذات الأهمية الحاسمة للصحة العامة في المحيطات، فضلا عن صحة الإنسان. ومع ذلك، بسبب التأثيرات البشرية مثل ارتفاع درجات حرارة المحيطات وتحمض المحيطات، الشعاب المرجانية يتزايد تحت التهديد. للتصدي لهذه التحديات، أثبتت التطورات في الخلية والبيولوجيا الجزيئية أن تكون حاسمة بالنسبة لتشخيص صحة الشعاب المرجانية. تعديل بعض التقنيات التي يشيع استخدامها في الطب البشري يمكن أن تحسن كثيرا من قدرة الباحثين على علاج وحفظ الشعاب المرجانية. لمعالجة هذا الوضع، قد وضع بروتوكول التهجين في الموقع تستخدم أساسا في الطب البشري وعلم الأحياء التنموي التطوري تطويعها للاستخدام في الشعاب المرجانية الكبار تحت الضغط.

والغرض من هذا الأسلوب هو تصور التعبير المكاني لإجراء تحقيق الجيش الملكي النيبالي في أنسجة المرجان الكبار التي تم تضمينها في البارافين ومقطوع على الشرائح الزجاجية. ويركز هذا الأسلوب على إزالة البارافين والاماهه للعينة، والمعالجة الأولية للعينة لضمان نفاذية العينة، التهجين ما قبل الحضانة، التهجين لمسبار الحمض النووي الريبي، والتصور لمسبار الحمض النووي الريبي. هذا أسلوب قوية عند استخدام الكائنات الحية غير نموذجية لاكتشاف حيث يتم التعبير عن الجينات محددة، والبروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لغيرها من الكائنات غير نموذجية. ومع ذلك، يقتصر الأسلوب في ذلك فإن النوعية في المقام الأول، نظراً لكثافة التعبير يمكن أن تختلف تبعاً لمقدار الوقت المستخدمة أثناء الخطوة التصور وتركيز التحقيق. وعلاوة على ذلك، الصبر مطلوب، كما هذا البروتوكول يمكن أن تصل إلى 5 أيام (وفي كثير من الحالات، أطول) استناداً إلى أن التحقيق يجري استخدامها. وأخيراً، تلوين الخلفية غير محددة أمر شائع، ولكن يمكن التغلب على هذا القيد.

Introduction

الشعاب المرجانية منشئي النظم الإيكولوجية الحرجة والهامة للتنوع البيولوجي في المحيطات وصحة الإنسان1،،من23. أنها تتعرض للتهديد بسبب تغير المناخ وغيرها من الضغوطات البشرية المنشأ، وتعتبر العديد من الأنواع المرجانية المهددة. ومن ثم، هناك حاجة كبيرة لأدوات الخلوية والجزيئية لتشخيص الشعاب المرجانية تحت الضغط. أيضا، هناك القليل من المعلوم حول حيث يتم التعبير عن الجينات داخل أنسجة المرجان الكبار، وذلك القليل فهم وظائف هذه الجينات. لمعالجة هذه المسألة، ونحن قد تكيفت في الموقع التهجين (العش) البروتوكول، يشيع استخدامها في الطب البشري وعلم الأحياء التنموي التطوري، لاستخدامها في عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين المرجان الكبار. هذا الأسلوب أقوى عندما تستخدم على الشعاب المرجانية الكبار التي شهدت حدثاً ضاغطة مثل التعرض للإجهاد الحراري. ومع ذلك، هذا الأسلوب يمكن استخدامها على مجموعة واسعة من الأنسجة ومراحل الحياة في الشعاب المرجانية ولا يقتصر على فقط أكد الحرارة المرجان4،،من67. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب في أنسجة أو خلايا من أي تواليات طالما هناك كدنا تسلسل المعلومات المتاحة.

والغرض من هذا الأسلوب هو تصور تحقيقات الجيش الملكي النيبالي داخل أنسجة المرجان الكبار التي تم الحفاظ عليها وجزءاً لا يتجزأ من البارافين ومقطوع على الشرائح. هذا الأسلوب هو أداة تشخيصية قوية تسمح لتصور الأحماض النووية داخل أنسجة المرجان الكبار. وقد وضعت في البداية هذا الأسلوب للتشخيص الطبي، ومنذ ذلك الحين أصبح أداة شعبية في مجالات مثل علم الأحياء التنموي وعلم الأحياء التنموي التطوري8،،من910. ايش أيضا طريقة حاسمة، لا سيما في نظم غير نموذجية، عندما الجينوم وترانسكريبتوميك تسلسل البيانات متوفرة ولكن أنماط التعبير الجيني المكاني غير معروفة. للحصول على عمل التشخيص في نظم غير نموذجية، هذا الأسلوب قوية نظراً لأنه يمكن الإشارة إلى الخلايا والأنسجة التي التعبير عن جين للفائدة، ويمكن أن يؤدي إلى أكثر النهج العلاجية المستهدفة8،،من910، 11،12. وأخيراً، أن هذا الأسلوب النوعية وأكثر قوة عندما يقترن مع البيانات التعبير الجيني الكمي11.

النهج المبين في هذه الورقة سوف تكون ذات فائدة للباحثين الذين يستطيعون مصممة بالفعل ديجوكسيجينين (حفر)-المسمى مسبار الحمض النووي الريبي (مجسات الإحساس وأنتيسينسي على السواء)، وهي الآن جاهزة لأداء التهجين في الموقع للتحقيقات بعينه. لتنفيذ هذا الأسلوب، سوف يلزم قسمين المسلسل من الأنسجة البارافين الشعاب المرجانية لكل التحقيقات التي يجري اختبارها. سيتم استخدام مقطع واحد للتحقيق المعني وأخرى للتحقيق العقاقير. التحقيق المعني سيكون عنصر تحكم للإشارة إلى الربط غير محددة. إذا تلطيخ الملاحظ في الإحساس بالتحقيق، ثم التحقيق العقاقير ليست محددة للجيش الملكي النيبالي للفائدة. يمكن تصميم المجسات للجينات أي أعرب. تستخدم العديد من الأمثلة في هذا البروتوكول، التي تم العثور عليها قبل أن يتم التعبير عنها من خلال الإجهاد الحراري في الشعاب المرجانية: فبج osteosarcoma مورين السرطاني الفيروسية هومولوج ب (المنحدر-ب)، البروتين المنشط (AP1)، وعامل نخر الورم مستقبلات 41 (41 تنفر)11. ايش استخدام المسابير المسمى حفر الجيش الملكي النيبالي المفضل على مدى استخدام المجسات الإشعاعية سبب تعاملها كثير أكثر أماناً من10. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هي حساسة للغاية ويمكن أن يؤديها على طائفة واسعة من الأنسجة والأجنة خارج الشعاب المرجانية الكبار أكد الحرارة13،14،،من1516.

Protocol

1-إزالة البارافين تحذير: الخطوات التالية تحت غطاء دخان. دو الشرائح جزءا لا يتجزأ من البارافين رقيقة-مقطوع بنسبة 100% زيلين نفط تحت غطاء محرك السيارة في الزجاج كوبلين الجرار لمدة 10 دقائق. لا تستخدم البلاستيك كوبلين الجرار، كما زيلين نفط يذوب البلاستيك. تعقيم الزجاجات كوبل…

Representative Results

بعد الانتهاء من هذا البروتوكول، وسيتم تحقيق تحديد الخلايا والأنسجة التي تعرب عن مسبار الحمض النووي الريبي للفائدة. نتائج تمثيلية لهذا البروتوكول لوكالة اسوشييتد برس-1 وفوسب و TNFR41. هذه النتائج، التي نشرتها سابقا نولز ترايلور et al. 11، يسبر إظهار التعبير ال…

Discussion

لقد تم تعديل الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول من الأعمال السابقة في البحوث الطبية والتطوري التنموي8،9،10،،من1217. هذا البروتوكول يركز على الفروق الدقيقة في التهجين في الموقع مع تحقيق معنى المضا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل بجائزة لا. أوس-1323652 من خلال no.1012629 “الوطنية علوم المحيطات العلم ما بعد الدكتوراه زمالة مؤسسة” وجائزة من “مؤسسة ويلكوم بوروز برنامج تخصيب صندوق ما بعد الدكتوراه”.

Materials

Denhardt's solution Affymetrix 70468 50 ML
Bioworld Alkaline phosphatase buffer Fisher 50-198-724
Slide mailers Fisher 12-587-17B
Bioworld Alkaline phosphatase buffer Fisher 50-198-724
50 mL Falcon tubes Fisher 14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solution Invitrogen 15632-011
PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Invitrogen AM9625
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL Invitrogen 10977-023
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL Invitrogen 10977-023
UltraPure Salmon Sperm DNA solution Invitrogen 15632-011
Slide white apex superior adhesive Leica Biosystems 3800080
PBS solution, pH 7.4 Life Technologies 10010072
Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL New England Biolabs P8107S
Super Pap Pen Liquid Blocker Promega 22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments Roche 11093274910
BM Purple, 100 mL Roche 11442074001
DIG Wash and Block Buffer Set Roche 11585762001
NBT/BCIP Roche 11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL size Sigma-Aldrich 252549-500ML
SSC Buffer 20X concentration Sigma-Aldrich S6639-1L
Acetic Anhydride Sigma-Aldrich 320102-100ML
Formamide Sigma-Aldrich 47670-250ML-F
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279-100ML
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
Xylenes, AR (ACS), For Histological Use VWR MK866806
Ethanol VWR EM-EX0276-4S
TE buffer VWR PAV6232
hybridization oven VWR 97005-252, 97005-254
Orbital shaker VWR 89032-088

References

  1. Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
  2. Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
  3. Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
  4. Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
  5. Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria – ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
  6. Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
  7. Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
  8. Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
  9. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
  10. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  11. Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
  12. Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
  13. Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
  14. Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
  15. Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
  16. Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
  17. Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).

Play Video

Cite This Article
Traylor-Knowles, N. In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples. J. Vis. Exp. (138), e57853, doi:10.3791/57853 (2018).

View Video