目前，白色脂肪组织（WAT）的主要原代培养模型存在关键缺陷，阻碍了药物开发和代谢研究的进展。本文介绍了一种通过将WAT夹在间充质细胞层之间来构建脂肪组织微生理系统的方法。该结构为WAT的原代培养提供了一个稳定且可调节的平台。
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本文内容
摘要
摘要
白色脂肪组织（WAT）在调节体重和日常健康中发挥着关键作用。然而，现有的原代培养模型存在显著局限性，均未能真实再现脂肪组织微环境，或使WAT的存活时间超过两周。可靠原代培养模型的缺乏严重阻碍了WAT代谢研究和药物开发。为此，我们依据美国国立卫生研究院（NIH）微生理系统标准，开发了一种新型WAT原代培养平台，称为“SWAT”（夹心式白色脂肪组织）。通过将切碎的WAT细胞簇夹在脂肪来源的基质细胞层之间，我们克服了脂肪细胞天然的浮力问题。在此结构中，WAT样本在体外培养中可存活超过八周。SWAT保留了完整的细胞外基质（ECM）、细胞间接触以及物理压力 体内 WAT 条件下；此外，SWAT 能够维持稳定的转录谱、对外源性化学信号的敏感性以及完整的组织功能。SWAT 是一种简单、可重复且高效的原代脂肪组织培养方法。该技术有望成为研究 WAT 生理学、病理生理学、代谢过程及药物开发的广泛应用平台。
引言
脂肪组织是肥胖症的主要器官，其在美国每年直接医疗费用介于1470亿至2100亿美元之间1。脂肪组织的积聚还会导致心脏病、2型糖尿病以及某些癌症等其他主要死亡原因2。体外培养模型对于代谢研究和药物开发至关重要，但目前的脂肪组织研究模型存在重大缺陷。脂肪细胞是脆弱、具有浮力且终末分化的细胞，无法贴附于细胞培养塑料表面，因此不能采用常规的细胞培养方法进行培养。自20世纪70年代以来，已有多种方法被尝试用于克服这些障碍，包括使用玻璃盖玻片、顶壁培养、悬浮培养以及细胞外基质等方法3,4,5,6,7。然而，这些方法常伴随细胞死亡和去分化现象，通常仅用于不超过两周的研究周期。此外，这些模型并未尝试重建天然脂肪组织微环境，因其未能维持完整的细胞外基质（ECM）、脂肪细胞与基质支持细胞之间的相互作用，以及体内白色脂肪组织（WAT）中细胞间相互施加的收缩力。
由于目前尚无公认的金标准原代脂肪细胞培养方法，脂肪组织研究主要依赖于分化后的前脂肪细胞....
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方案
所有操作均按照LSUHSC-NO机构审查委员会（IRB）批准的方案#8759和#9189执行。所有动物实验均按照LSUHSC-NO机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案#3285执行。
1. 夹心细胞片的接种
注意：见图1。
- 在组织培养板（6 cm 或 6 孔板）中以约 80% 汇合度接种 ADSCs。每制备一孔 SWAT，需接种一孔常规组织培养板以及一孔相应尺寸的聚(N-异丙基丙烯酰胺)（pNIPAAm）包被的组织培养塑料板。
注意：因此，进行一次SWAT实验需要在一个6孔标准组织培养板（底层）和一个6孔pNIPAAm涂层组织培养板（上层）上分别接种细胞。pNIPAAm涂层板可从商业途径购买，也可在实验室自行制备。12,13,14. - 将ADSCs在37 °C和5% CO₂条件下培养2 在添加了10% FBS和1×青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中. 每2天更换一次培养基。
- 待细胞融合至100%并呈现条纹状排列（约6–8天）。<....
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结果
通过在约7.6周内对单个WAT细胞簇（n = 12）进行连续明场成像，初步评估了SWAT的存活能力。在此期间，细胞簇始终固定在单层上。观察到轻微的形态学变化，个别脂肪细胞略有变形或位置移动。然而，脂肪细胞随时间推移并未出现多房性结构，表明未发生去分化，也未表现出细胞死亡的可见迹象，如细胞出泡、裂解或碎片化（图2）。通过脂质染料尼罗红（NR）对培养两周的SWAT进行染色，确认了细胞簇的脂肪细胞特性。单房性脂肪细胞簇呈现清晰的NR染色，表明这些确实是具有完整细胞膜的脂肪细胞，而非人工假象、囊肿或死亡脂肪细胞。周围ADSC层未见NR染色，表明这些细胞未积累脂质，因而自身未向脂肪细胞谱系分化（图3a）。对培养53天的SWAT进行碘化丙啶染色，在后期时间点脂肪细胞簇内未见染料摄入，表明无细胞死亡发生（图3b）。对培养51天的SWAT进行油红O（ORO）染色，脂质染色定位于固定的脂肪细胞簇内，表明即使在后期.......
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讨论
本方案详细介绍了使用脂肪源性基质细胞（ADSCs）包裹人白色脂肪组织的方法；人源ADSC细胞系可通过成熟的既定方案分离获得15。然而，该系统可根据个体化研究需求进行调整（例如，使用3T3L-1细胞包裹小鼠WAT）。该操作涉及人原代组织的处理，应采取标准安全防护措施；将人组织视为生物安全二级（BSL-2）病原体（例如，HIV、HepC）进行操作。所有组织操作必须在生物安全柜（BSC）内进行。穿戴机构安全标准规定的全部适当个人防护装备（PPE），强烈建议佩戴双层手套。所有用品和废弃物在重复使用或丢弃前，须用10%次氯酸钠溶液或70%乙醇溶液彻底消毒。
SWAT 培养的首个关键步骤是获取并维持经 pNIPAAm 涂层的组织培养板。此类培养板可从商业途径获得，也可通过既定方法自行制备。12,13,14这些培养板具有温度响应性的细胞培养表面。.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢路易斯安那州立大学健康科学中心提供的机构支持，该中心为本项目提供了资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| 明胶 | Sigma-aldrich | G9391 | |
| 胶原酶 | Sigma-aldrich | C5138 | |
| 腺苷 | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 培养基 | Thermofisher | 11043023 | 无酚红 |
| 250 µm 网格滤器 | Pierce | 87791 | |
| 0.2 µm 注射器滤器 | Celltreat | 229747 | |
| 5 mL 鲁尔锁注射器 | BD | 309646 | |
| 金属垫圈 | 这些是普通的金属垫圈，可在任何五金店购买。它们可为冲头背面提供适当重量，以确保细胞与明胶之间均匀接触，同时易于储存和灭菌。近似质量：6.3 g | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 加热设备 | |||
| 恒温振荡摇床 | VWR | 10020-988 | 样品应以45°倾斜角放置，以促进胶原酶消化 |
| 加热块 | 设定为37–40 °C，并置于生物安全柜下方 | ||
| 水浴锅 | 设定为约75 °C | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 专用塑料器皿 | |||
| Upcell 培养皿（6 cm）或 6 孔板 | Nunc | 174902 或 174901 | 这些是市售的聚异丙基丙烯酰胺（pNIPAAm）包被培养皿，可用于培养ADSC的上层细胞层。也可在实验室自行制备pNIPAAm包被的培养板。直径：<6 cm（6 cm培养皿），<3.5 cm（6孔板）；近似质量：6 cm培养皿为6.7 g，6孔板为5.1 g |
| 塑料冲头装置 | 可定制以适配所需的pNIPAAm包被塑料器皿（多孔板、培养皿）。其结构由连接至圆形盘片的简单杆状部分组成。可在实验室自制，或由具备丙烯酸塑料加工能力的机构加工制作 |
参考文献
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
- Smith, U.
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