Een Microphysiologic Platform voor menselijk vet: ingeklemd wit vetweefsel

Summary

Witte vetweefsel (WAT) heeft kritieke tekortkomingen in de huidige primaire cultuur modellen, belemmeren farmacologische ontwikkeling en metabole studies. Hier presenteren we een protocol voor de productie van een systeem van de obesitas microphysiological door klemmen WAT tussen bladen van stromale cellen. Deze constructie biedt een stabiele en flexibele platform voor primaire WAT cultuur.

Abstract

Witte vetweefsel (WAT) speelt een cruciale rol bij het reguleren van gewicht en dagelijks gezondheid. Er zijn echter belangrijke beperkingen aan beschikbaar primaire cultuur modellen, die allemaal gelukt te trouw de obesitas communicatie recapituleren of WAT levensvatbaarheid na twee weken uit te breiden. Het gebrek aan een betrouwbare primaire cultuur model belemmert ernstig onderzoek in WAT metabolisme en Geneesmiddelenontwikkeling. Daartoe hebben we de NIH normen van een microphysiologic systeem voor de ontwikkeling van een nieuw platform voor primaire cultuur WAT genaamd ‘SWAT’ (ingeklemd witte vetweefsel) gebruikt. We overwinnen de natuurlijke drijfvermogen van adipocytes door sodat gehakt WAT clusters tussen bladen van adipeus-afgeleide stromale cellen. In deze constructie zijn WAT monsters levensvatbaar meer dan acht weken in cultuur. SWAT onderhoudt de intact ECM, cel-naar-cel contactpersonen en fysieke druk van in vivo WAT voorwaarden; Daarnaast onderhoudt SWAT een robuuste transcriptionele profiel, gevoeligheid voor exogene chemische signalen, en hele weefsel functie. SWAT vertegenwoordigt een effectieve, eenvoudige en reproduceerbare methode van primaire obesitas cultuur. Potentieel, is het een breed toepasbare platform voor onderzoek in WAT fysiologie, pathofysiologie, metabolisme en farmaceutische ontwikkeling.

Introduction

Adipeus weefsel is het belangrijkste orgaan van obesitas, dat bestemd is voor rechtstreekse jaarlijkse medische kosten tussen $147 miljard en 210 miljard dollar in de US¹. De ophoping van vetweefsel draagt ook bij tot andere belangrijkste doodsoorzaken zoals hart-en vaatziekten, diabetes type II en bepaalde soorten kanker². In vitro cultuur modellen zijn essentieel voor metabole studies en Geneesmiddelenontwikkeling, maar de huidige onderzoeksmodellen van vetweefsel hebben grote tekortkomingen. Adipocytes zijn kwetsbaar, veerkrachtige en terminaal gedifferentieerde cellen die niet voldoet aan de cel cultuur kunststoffen, en daarom niet kunnen worden gekweekt met behulp van conventionele cel kweekmethoden. Sinds de jaren 1970, hebben verschillende methoden gebruikt in pogingen om deze belemmeringen, waaronder het gebruik van glas coverslips, plafond cultuur, cultuur van de opschorting en extracellulaire matrices^{3,4,5, 6 , 7}. echter, deze methoden werden gekenmerkt door celdood en dedifferentiation, en ze worden doorgaans gebruikt voor niet meer dan een twee weken durende studieperiode. Bovendien, deze modellen niet proberen de inheemse obesitas communicatie recapituleren als ze niet kunnen het intact ECM bewaren, de interacties tussen adipocytes en stromale cellen steunen, noch de cellen contractiele krachten op elkaar in in vivo uitoefenen WAT.

In de afwezigheid van een gouden standaard primaire obesitas cultuur-methode, heeft obesitas onderzoek ingeroepen voornamelijk gedifferentieerde pre adipocytes (diffAds). DiffAds zijn multilocular, aanhangend en metabolisch actief. Daarentegen, primaire witte adipocytes zijn unilocular, nonadherent, en getuigen van de relatief lage stofwisseling. Het falen van de huidige obesitas cultuur modellen te recapituleren de Fysiologie van gezonde volwassen adipeus weefsel is waarschijnlijk een belangrijke factor bij gebrek aan FDA-goedgekeurde medicijnen die rechtstreeks gericht zijn op adipocytes. In feite, is het gebrek aan fysiologische in vitro orgel modellen een groot probleem in de meeste organen en ziekte.

In haar stellingname aankondiging van de oprichting van het programma van de Microphysiological systemen (MPS), de National Institutes of Health (NIH) gemeld dat het slagingspercentage van 2013 over alle menselijke farmaceutische klinische proeven slechts 18% voor fase II en 50% voor fase III was klinische proeven⁸. Het MPS programma is ontworpen om direct het onvermogen van in vitro monocultuur te model menselijke fysiologie. De NIH definieert MPSs als cultuur systemen bestaat uit menselijke primaire of stamcellen in meercellige 3D constructies die orgel werking recapituleren. In tegenstelling tot reductionistische modellen van homogene, vereeuwigd celculturen, moet de MPSs nauwkeurig model cel, drug-cel, drug-drug en orgel-drug interacties⁹. In tegenstelling tot korte termijn primaire kweekmethoden dicteren NIH normen MPS duurzaamheid meer dan 4 weken in cultuur⁸. Verdere details van het MPS programma vindt u op de de NIH RFAs (#RFA-TR-18-001)¹⁰.

We hebben ontwikkeld, een eenvoudig, roman, flexibel, en goedkope obesitas MPS genoemd “ingeklemd witte vetweefsel” (SWAT)¹¹. We overwinnen de natuurlijke drijfvermogen van adipocytes door “sodat” gehakt primaire adipeus weefsel tussen bladen van adipeus-afgeleide stromale cellen (ADSCs) (Figuur 1). De resulterende 3D constructie recapituleert de cel-cel-contact en de inheemse obesitas communicatie door omringende volwassen adipocytes met een natuurlijke adipocyte ondersteuning-celpopulatie. SWAT is gevalideerd door het tonen van de 8-weekse levensvatbaarheid, reactie op exogene signalering, de secretie van de adipokine en engraftment in een dierlijk model.

Protocol

Alle taken werden uitgevoerd in naleving protocollen #8759 en #9189, zoals goedgekeurd door de IRB Office van LSUHSC-NO. Alle dierlijke werk werd uitgevoerd in naleving van protocol #3285 goedgekeurd door het Bureau van de IACUC op LSUHSC-nr. 1. zaaien van sodat cel bladen Opmerking: Zie Figuur 1. Zaad ADSCs op ongeveer 80% confluentie in weefselkweek platen (6 cm of 6-Wells-platen). Voor elk putje van SWAT gewenst, seed 1 con…

Representative Results

Levensvatbaarheid van SWAT was in eerste instantie beoordeeld door seriële helderveld beeldvorming van individuele WAT clusters (n = 12) ongeveer 7,6 weken. Clusters bleef beveiligde in plaats op de enkelgelaagde gedurende deze tijd. Lichte morfologische veranderingen werden waargenomen met individuele adipocytes iets kromtrekken of posities verschuiven. Maar, adipocytes evenmin worden multilocular na verloop van tijd, met vermelding van een gebrek aan dedifferentiation, noch deed ze ver…

Discussion

Dit protocol gegevens het gebruik van ADSCs om sandwich menselijke witte adipeus weefsel; menselijke ADSC cellijnen kunnen worden geïsoleerd via gevestigde protocollen¹⁵. Het systeem kan echter aangepast voor geïndividualiseerde onderzoek eisen (zoals het gebruik van sandwich muis WAT cellen 3T3L-1). Dit proces omvat de behandeling van primaire menselijk weefsel. Standaard voorzorgsmaatregelen moeten worden gebruikt; omgaan met menselijke weefsels als BSL-2 pathogenen (bijvoorbeeld HIV,…

Materials

10x HBSS	Thermofisher	14185052
Gelatin	Sigma-aldrich	G9391
Collagenase	Sigma-aldrich	C5138
Adenosine	Sigma-aldrich	A9251
DMEM	Thermofisher	11995065
M199 Media	Thermofisher	11043023	Phenol red-free
250µm Mesh Filter	Pierce	87791
0.2µm Syringe Filter	Celltreat	229747
5mL Luer-Lok syringes	BD	309646
Metal Washers			These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g
Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker	VWR	10020-988	Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block			Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath			Set to ~75°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell	Nunc	174902  or 174901	These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus			These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics