Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit
Summary
Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.
Abstract
Bu iletişim kuralı, bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon protein ve 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) boyama protein hücre altı yerelleştirme değişiklikleri; izlemek için kullanılır Özellikle, bir ısı altında nükleer translocation stres durumu. Proteinler buna bağlı olarak dış ve iç sinyalleri tepki. Onun hücre altı yerelleştirme değiştirmek için ortak bir mekanizmadır. Bu makalede bir antikor, radyoaktif etiketleme veya confocal mikroskop gerektirmez protein yerelleştirme izlemek için bir iletişim kuralı. Bu makalede, GFP memeli CLIC4 de dahil olmak üzere klorür hücre içi kanal proteinleri (CLICs) ailesinin C. elegans, üye EXL-1 hedef protein etiketlemek için kullanılır. Bir entegre translasyonel exl-1::gfp transgenik satır (bir organizatörü ve tam gen sıralaması) dönüştürme ve γ-radyasyon tarafından oluşturulmuş ve stabil gfpve gen ifade eder. Son araştırma ısı stres, değil oksidatif stres, EXL-1::GFP çekirdeğinde biriken gösterdi. GFP sinyal çekirdek yapısı ve DAPI ile örtüşen sinyalleri stres altında EXL-1 hücre altı yerelleştirme değişiklikleri onaylar. Bu iletişim kuralı DAPI boyama için iki farklı fiksasyon yöntemi sunar: etanol fiksasyon ve aseton fiksasyon. Bu makalede sunulan DAPI boyama iletişim kuralı hızlı ve verimli ve GFP sinyal hem protein hücre altı yerelleştirme değişiklikleri korur. Bu yöntem yalnızca Nomarski, FITC filtre ve DAPI filtre ile floresan mikroskop gerektirir. Bir küçük laboratuvar ayarı, lisans öğrencisi araştırma, lise öğrenci araştırma ve biyoteknoloji derslik için uygundur.
Introduction
Protein hücre altı yerelleştirme değişikliği yanıt olarak dahili veya harici sinyaller ısı stres, açlık, oksidatif stres, apoptozis, protein fosforilasyon ve diğerleri gibi ortak bir mekanizmadır. Örneğin, ısı stres FOXO üye DAF-16 nükleer translocation1,2ve3,4sinyal alıcı ölümü üzerine mitokondri için teklif translocates pro-apoptotik BCL-2 protein neden olmaktadır. Çeşitli teknikler bu değişiklikleri algılamak kullanılabilir. Western blot ve biyokimyasal olarak izole hücre altı yapıları (Örneğin, mitokondri veya çekirdek) bir arada de hedef3elde edebiliriz. Ancak, spesifik bir antikor protein ilgi karşı gerektirir. Böylece, köklü bir antikor başarı için anahtar olur. Farklı hücre altı yapıları veya organelleri yeşil floresans protein (GFP), kırmızı floresans protein (RFP), sarı floresans protein (YFP) ve mCherry gibi çeşitli işaretçileri olan etiket ve bu arada protein etiket için alternatif bir yaklaşımdır ilgi diğer işaretleri ile. O zaman, onları hedef5,6yerelleştirmek için confocal mikroskop altında gözlemlemek. Radyoaktif izotoplar hedef proteinler etiketleme ve onların hücre altı yerelleştirme7algılama için alternatif bir seçimdir. Ancak, bu yöntem uygun eğitim ve radyoaktif atıkların işlenmesi gerekir. Spesifik bir antikor eksikliği, uygun bir işaretleyici yokluğu veya ekipman confocal mikroskop gibi scarceness gibi bu şartlar altında başka bir yaklaşım dikkate alınması gerekiyor. Protein nükleer translocation tanımlamak için sadece bir işaretleyici ile hedef proteinler etiketlemek için ve çekirdeklerin Kimyasal reaktif 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (Bu sadece normal floresan mikroskop gerektirdiğinden DAPI) ile leke için çekici.
Immunolabeling C. elegans antikorlar ile yumurta kabuğu veya hayvan çevreleyen kolajen kütikül düşük geçirgenliği nedeniyle meydan okuyor. Bu arada, C. elegans proteinler–dan onların omurgalı orthologs önemli ölçüde farklı olduğu için birkaç ticari şirketler ile belirli ürünler C. elegans sağlar. C. elegans antikorlar kendileri için üretmek küçük bir laboratuvar için zordur. Araştırmacılar toplumda sık sık tagged proteinler protein yerelleştirme veya gen ifade göstermek için imleyicileri kullanın. Bu makale EXL-1::GFP bir protein nükleer translocation ısı stres8altında izlemek için örnek olarak kullanılmıştır. Bir entegre translasyonel exl-1::gfp içine hayvan genom stabil gen gfp füzyon ile ifade etmek için kullanılır. Araştırma exl-1 bağırsak, vücut duvar kas ve diğer hücre altı yapıları8ifade edilir gösterdi. Bu iletişim kuralı, solucanlar dördüncü larva (L4) sahneye eşleştirir, ısı stres deney ve davranış DAPI boyama, etanol fiksasyonu, aseton fiksasyon ve görüntüleme düzenli floresan mikroskop altında gerçekleştirmek gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale için çekirdek sitoplazma protein hücre altı değişiklikleri doğrulamak için hızlı ve etkili bir yöntem mevcuttur. Çekirdek yapı (Şekil 3) boyama DAPI tarafından doğrulandı ise protein ifade GFP füzyon tarafından gösterildi. İmmunostaining C. elegans proteinler zor olduğundan, çoğu C. elegans protein hücre altı yerelleştirmeler GFP, Laz, mCherry ve diğerleri gibi işaret proteinler ile etiketleyerek karakterizedir18</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada kullanılan C. elegans suşları Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından – Office of araştırma altyapı programları (P40 OD010440) desteklenen Caenorhabditis genetik Merkezi’nden elde edilmiştir. Bu eser NIH tarafından desteklenmiştir: 1R03AG048578-01 Jun Liang, Jun Liang ve PSC CUNY-CCRG 1501-CUNY 66184-00 44 ve 67248-00 45 Jun Liang için. Cathy Savage-Dunn nazikçe onu laboratuvar alanı paylaşımı için teşekkür ederiz. Tüm floresans görüntüleri Queens Koleji çekirdek tesisinde toplanmıştır. William J. Rice el yazması üzerine onun yorum için teşekkür.
Materials
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
References
- Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
- Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
- Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
- Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
- Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).
- Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
- Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
- Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , (2006).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , (2006).
- Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
- Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
- Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
- He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
- Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
- Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
- Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).
- Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
- Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
- Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
- Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
- Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. 遗传学. 198 (1), 193-207 (2014).
- Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
- Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).
