急性癫痫发作模型对于研究癫痫样事件的潜在机制具有重要意义。此外，能够按需诱导癫痫样事件的能力为研究其发生过程中事件的精确序列提供了一种高效的方法。本文中，我们描述了在小鼠和人类组织中建立的急性4-氨基吡啶皮层癫痫发作模型。
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摘要
摘要
控制癫痫发作仍是医学界面临的一项挑战性难题。为了取得进展，研究人员需要一种能够广泛研究癫痫发作动态并探究其潜在机制的方法。急性癫痫模型使用便捷，可进行电生理记录，并能产生大量类似癫痫发作（痫性）的脑电事件。急性癫痫模型中获得的有希望的研究发现，可进一步推进至慢性癫痫模型和临床试验。因此，研究能够真实再现临床癫痫发作脑电特征和动态特性的急性模型中的癫痫发作，对于获得具有临床相关性的发现至关重要。使用人源组织制备的急性癫痫模型来研究痫性事件，同样对获得具有临床相关性的结果具有重要意义。本文的重点在于皮层4-AP模型，因其在体内（in vivo）和体外（in vitro）研究中，以及在小鼠和人源组织中均能灵活地诱导痫性事件。本文还将介绍一种使用无镁（Zero-Mg2+）模型诱导癫痫发作的替代方法，并详细概述不同急性癫痫模型所产生的类癫痫样活动的优势与局限性。此外，利用 commercially available 的光遗传学小鼠品系，可通过短暂（30 ms）的光脉冲触发与自发发作完全相同的痫性事件。类似地，向人源组织施加30–100 ms的神经递质（γ-氨基丁酸或谷氨酸）喷雾，也可触发与自发发作完全相同的痫性事件。在急性癫痫模型中按需触发痫性事件的能力，为观察癫痫起始动态背后的精确事件序列，以及高效评估潜在抗癫痫治疗手段提供了全新的可能。
引言
急性癫痫发作模型能够成功再现类似于癫痫患者脑电图（EEG）中观察到的痫性事件的电生理特征。研究人员将这些类痫性事件（本文中简称为“痫性事件”）作为癫痫发作事件的替代指标1。临床上，由于癫痫发作是一种起源于大脑的神经系统疾病，因此痫性事件可作为癫痫发作的可靠替代指标。在癫痫监测单元中，神经科医生依赖于痫性事件的检测，以确认大脑的致痫区域，并将其分离以便手术切除2。在重症监护病房中，医生通过监测痫性活动来评估镇静患者是否仍存在癫痫样电活动3。控制癫痫发作对医学界而言仍是一项挑战，因为30%的癫痫患者对现有药物具有耐药性4,5，而涉及药物诱发癫痫的病例中，有10%对标准治疗无反应3。这一问题对社会构成了严重关切，据估计，美国人口中有10%在其一生中将经历至少一次癫痫发作事件，其中3%预计将发展为癫痫6。
在慢性癫痫模型中研究癫痫发作成本高昂、费时费力，且通常需要数月时间进行准备7。此外，在自由活动的动物中进行电生理记录也十分困难。人类临床试验面临类似问题，同时还涉及受试者知情同意、参....
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方案
所有涉及患者的科研工作均在多伦多大学健康网络研究伦理委员会根据《赫尔辛基宣言》批准的方案下进行。涉及动物的实验程序均遵循加拿大动物护理委员会的指导方针，并经克伦比尔研究所动物护理委员会批准。
1. 方案一：急性模型 体外 癫痫模型
- 灌注液与人工脑脊液的制备
- 将超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm的过滤水）通入碳 dioxide 和氧气混合气体（即 Carbogen）进行饱和Ω·cm）通入碳合气（95% O₂，5% CO₂）2/5% CO₂2使用气石曝气器（水族箱用增氧器）通气 5 分钟。
注：气石可连接至碳合气体罐的调节器 通过 标准硅胶管。若无气石，可将硅胶管末端密封，并在密封处戳若干小孔，使碳合气（carbogen）由此形成气泡通入溶液并完成碳合。 - 通过溶解溶质来配制解剖液 表1 在超纯水中。加入 CaCl2 加入已通入碳合气体至少5分钟的溶液中，以助其溶解。
注意：或者，添加 CaCl2 首先，使其在未饱和溶液中易于溶解。该溶液在液态时应为300 - 320 mOsm/L，并在用碳合气饱和后pH值达到7.4。- 将解剖液冷却至 0 - ....
- 将超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm的过滤水）通入碳 dioxide 和氧气混合气体（即 Carbogen）进行饱和Ω·cm）通入碳合气（95% O₂，5% CO₂）2/5% CO₂2使用气石曝气器（水族箱用增氧器）通气 5 分钟。
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结果
应用 100 µM 4-AP 至高质量（无损伤） 450 µm来自幼年VGAT-ChR2小鼠的大脑皮层脑片可靠地诱导出复发性痫性发作事件（> 5 秒）内，在 15 分钟内（图 1Ai）。应用 100 µM 4-AP 作用于质量较差的脑片时，引发爆发性事件或簇状放电活动（图1Aii）。平均而言，每只解剖小鼠脑组织获得的脑片中有40%能够成功诱发痫性发作事件。此外，在30只被解剖的小鼠中，有83%（25/30）的小鼠至少有一片脑片成功诱发了痫性发作事件。在可自发产生痫性发作事件的脑片中，对脑片施加一次短暂的30 ms光脉冲可稳定地触发一次与自发事件形态完全相同的痫性发作图 1Aiii 和 1Aiv）。在 Thy1-ChR2 小鼠的脑切片中也获得了相同的结果（图1B）。因此，无论哪一类神经元亚群被激活，.......
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讨论
脑片需用促惊厥药物或成分改变的人工脑脊液（ACSF）灌注，以提高神经网络的兴奋性，并促进痫样事件（电生理记录中的癫痫样事件）的发生。对于小鼠，首选包含躯体感觉-运动区的冠状切面，应包括扣带皮层第2区（CG），但不包含后顶叶皮层区（RS）；这些解剖标志有助于确定最适合诱发痫样事件的冠状切片范围。针对小鼠组织的一种可选处理方法是将脑片的两个半球各自切成两半，用于配对实验设计，因为两个半球在结构上几乎完全相同（即相似的实验单元）。在制备用于诱发痫样事件的脑片时，必须保持神经网络及其突触连接的完整性，因为痫样事件本质上是一种神经网络现象。在方案步骤1中，有三个对脑片质量至关重要的环节：1）切片过程，2）孵育，以及3）供氧。首先，切片过程需要在速度与技术之间取得平衡。必须尽量缩短断头（或手术切除）与开始孵育之间的时间，同时在操作脑片时需格外小心每一次接触和移动，以避免损伤。其次，组织质量对孵育温度和时间非常敏感。必须使用计时器和温度计，确保孵育条件为35 °C、持续30分钟。第三，脑组织的存活能力对是否暴露于充分氧合的（人工）脑脊液之外极为敏感。若脑片长时间（约1分钟）未用含碳合气的ACSF灌注，将导致组织死亡。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了加拿大卫生研究院（Peter L. Carlen 和 Taufik A. Valiante 获资助号 MOP 119603）、安大略脑研究所（Taufik A. Valiante 获资助）以及Mightex学生研究基金（Michael Chang 获资助）的支持。我们感谢 Liam Long 在拍摄本视频稿件过程中提供的协助。我们谨向 Paria Baharikhoob、Abeeshan Selvabaskaran 和 Shadini Dematagoda 致谢，感谢他们在整理本文稿件中的图表方面所提供的帮助。图1A、图3A、图4A 和 图6A 均为根据 Chang 等16 发表的数据制作的原创图表。
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参考文献
- Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
- Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilep....
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