Caenorhabditis Zeef: Een Low-tech Instrument en methodologie voor het sorteren van kleine meercellige organismen
Summary
Het huidige protocol bevat een methode voor het sorteren en het schoonmaken van leeftijd-matched populaties van Caenorhabditis elegans. Het gebruikt een eenvoudig, goedkoop, en efficiënt instrument is op maat te verkrijgen een grote experimentele populatie van nematoden voor onderzoek.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een reeds lang gevestigde model-organisme gebruikt in een heel scala van fundamenteel en biomedisch onderzoek. Binnen de nematode onderzoeksgemeenschap is er een behoefte aan een betaalbare en effectieve manier om grote, leeftijd-matched populaties van C. elegans. Hier presenteren we een methode voor het mechanisch sorteren en reiniging van C. elegans. Ons doel is om een rendabel, efficiënt, snel en eenvoudig proces om te verkrijgen van dieren van uniforme afmetingen en levensfasen voor hun gebruik in experimenten. Deze tool, zeef Caenorhabditis hanteert een custom-built deksel die draden op gemeenschappelijke conische lab buizen en sorteert C. elegans gebaseerd op lichaamsgrootte. We laten ook zien dat de Caenorhabditis zeef effectief dieren van één cultuur plaat brengt naar een ander toe te staan voor een snelle sorteren, synchroniseren, en het schoonmaken zonder de beïnvloedende markers van gezondheid, met inbegrip van de motiliteit en stress-afleidbare gen de verslaggevers. Deze toegankelijk en innovatieve tool is een snelle, efficiënte en niet-stressvolle optie voor het handhaven van C. elegans populaties.
Introduction
De nematode worm, Caenorhabditis elegans, is een premier model-organisme. Naast het eenvoudig en gecontroleerde karakter van hun teelt in het laboratorium, hun gehele genoom is gesequenceerd1 en het ontwikkelings lot van elke cel2is bekend. Als gevolg van deze functies is C. elegans een veel gebruikte modelorganisme voor genetische studies. Nochtans, samen met deze gunstige kenmerken komen sommige uitdagingen voor onderzoekers. Als gevolg van hun snelle generatietijd, C. elegans populaties kunnen snel opraken van voedsel en/of populaties met meerdere generaties worden gemengd en ontwikkelingsstadia presenteren in een keer. Zo vereisen experimenten uitgevoerd op solide nematode groei media (NGM) onderzoekers om fysiek naar dieren verse platen voordat de bacteriële voedselbron uitput en nieuwe larven ontwikkelen. Dit kan vervelend zijn als een frequente overbrengen van de dieren is nodig om te voorkomen dat de experimentele populaties van steeds vermengd met generaties nakomelingen. Enkele experimenten vereisen nog, beide grote aantallen dieren en langere tijd punten (bijvoorbeeld, DNA of RNA extractie in volwassenheid). Deze verbindingen de uitdagingen van nauwkeurig vasthouden van een gesynchroniseerde bevolking en de overdracht van grote aantallen dieren.
Huidige methoden van de overdracht van C. elegans gekweekte op NGM zijn plukken of wassen van de dieren uit plaat op plaat; chemisch behandeling van de dieren (bijvoorbeeldmet de DNA-replicatie remmer fluorodeoxyuridine of FUDR); of stroom cytometry gebruikt voor het sorteren van de dieren in de multi goed platen. Picken impliceert het gebruik van een handje, gemaakt met een dunne draad van platina of een wimper, handmatig overbrengen individu of meerdere dieren3,4. Deze methode is nauwkeurig maar vereist zowel de vaardigheid en de tijd en is een beperking voor studies waarbij grote aantallen dieren. Mei ook plukken worden fysiek schadelijk en stressvolle tot aan de dieren door individuen mogelijk te onderwerpen aan onnatuurlijk en inconsistent bedragen van verstoring en kracht. Wassen gaat spoelen van een cultuur-schotel met een bufferoplossing en overbrengen van de oplossing met de dieren via glazen pipet van Pasteur aan een nieuwe plaat van de cultuur. Deze methode is snel en efficiënt, maar is niet juist als meerdere generaties en ontwikkelingsstadia van dieren worden overgebracht in bulk. Chemische behandelingen, zoals FUDR, kunnen worden ontbonden in de kweken media om te voorkomen dat de productie van nakomelingen door het blokkeren van een DNA-replicatie, en dus de gameet-productie en ei-ontwikkeling. Tijdje effectief, deze methode moet worden toegepast na developmental rijping over niet verstoren de normale ontwikkelings processen, en dit betekent dat er nog steeds sprake is van een eis tot overdracht van de dieren vóór haar administratie3. Deze methode beïnvloedt ook meerdere mobiele signalering van trajecten, wat resulteert in merkbare gevolgen voor de dieren, naarmate zij ouder worden (b.v., een verlenging van de levensduur of een gewijzigde proteostasis) afhankelijk van de stam van C. elegans gebruikt5, 6,7,,8,,9,10. Stroom cytometry methoden automatisch sorteren en individuele C. elegans van één Multi goed bord overbrengen in een andere11. Hoewel deze methode zeer effectief en efficiënt is, is stroom cytometry apparatuur onbetaalbaar duur en ontoegankelijk voor veel onderzoekers. Een alternatief voor het overbrengen van de dieren is het gebruik van mutant modellen die zijn temperatuur gevoelig, zoals fer-15 en fem-1, die steriel met temperatuur aanpassing12geworden. Terwijl met behulp van mutant dieren nuttig in sommige situaties is, deze specifieke stammen groeien langzamer dan wild-type dieren en ze rekenen op een gewijzigde genoom, arme vertegenwoordigers voor veroudering of gezonde wormen bijeenkomen. Bovendien, de afhankelijkheid van een verschuiving van de temperatuur ertoe steriliteit resulteert ook in het ontbreken van een statische omgeving en temperatuurveranderingen gemakkelijk is aangetoond dat de invloed van gen expressies13,14, 15. onderzoeksgroepen technieken met een beschrijving van het gebruik van een Maas wilt filteren C. elegans grootte16eerder hebt gepubliceerd. Maar waren we niet in staat om vorige werk testen op eventuele wijzigingen in de algemene gezondheidsresultaten dat geassocieerd met het gebruik van deze filters worden kunnen te vinden.
Er is dus behoefte aan een binnen de Gemeenschap van C. elegans onderzoek een betaalbare, efficiënte, snelle en nauwkeurige methode voor het overbrengen van grote aantallen dieren tussen cultuur platen. We hebben een verbeterde, toegankelijke stuk van apparatuur (genoemd de Caenorhabditis zeef) en een bijbehorende protocol voor de fabricage en de werking die voldoet aan de behoeften van de onderzoekgemeenschap C. elegans ontwikkeld. Hierin delen we het ontwerp van de Caenorhabditis zeef en methoden voor het gebruik ervan, en we laten zien dat het gebruik ervan heeft geen gevolgen voor de gezondheid van de gemeenschappelijk of eventuele stress markeringen in vergelijking met standaard manuele picking en een behandeling met de veelgebruikte, beperking van de vruchtbaarheid chemische FUDR.
Protocol
Representative Results
Discussion
We geïntroduceerd hierin, het ontwerp en gebruik van een toegankelijke, effectieve Caenorhabditis zeef als een instrument voor het sorteren en het onderhouden van C. elegans. Dit hulpmiddel heeft verschillende voordelen aan het handmatig plukken van individuele dieren, het wassen van populaties, chemische behandelingen (bijvoorbeeldFUDR) of duurder methoden van laagniveau dieren. Ten eerste, de Caenorhabditis zeef efficiënt en snel (minder dan 20 min) sorteert nakomelingen van grote …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Heather Currey voor haar eerste bijdrage aan de studie ontwerp, en Dr. Swarup Mitra voor zijn kritische beoordeling van het manuscript. Ook bedank wij Dr. Michael B. Harris voor opmerkingen, verbeteringen en bijstand bij het opstellen van de demonstratie van deze methodologie. De stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt gefinancierd door het Bureau van de NIH onderzoek infrastructuur programma’s (P40 OD010440). Het onderzoek in deze publicatie gerapporteerd werd gesteund door de National Institute Of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Award nummers UL1GM118991, TL4GM118992 of RL5GM118990 en door een institutionele Development Award (idee) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder grant nummer 5P20GM103395-15. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health. UA is een AA/EO werkgever en onderwijsinstelling en verbiedt onwettige discriminatie tegen een individu: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
References
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. 遗传学. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 遗传学. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. 遗传学. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
