핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브
Summary
이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.
Abstract
핵의 기계적 속성 응답 세포에서 생성 된 기계적인 힘을 결정 합니다. 핵 분자로 골격과 연속 이므로 메서드 부착 세포의 기계적 동작을 필요 합니다. 여기, 우리가 살아있는 부착 세포에서 핵에 직접 힘을 적용 하는 도구로 직접 힘 프로브 (DFP) 토론. 우리는 흡입과 핵 표면에 좁은 micropipette를 연결합니다. micropipette는 변형 하 여 번역 핵 핵 거리 변환 됩니다. 복원 힘은 흡입 힘, 핵 분리 되 고 탄력적 이완. 흡입 압력을 정확 하 게 알려져 있다, 때문에 핵 표면에 강제로 알려져 있다. 이 메서드는 나노 스케일 세력 변형 및 부착 세포에서 핵을 번역 하기에 충분 되며 저항 세력에 핵을 사용할 수 있는 cytoskeletal 요소를 식별 밝혔다. DFP는 살아있는 세포에서 핵 기계적 속성의 구성 요소 세포질과 핵의 기여를 해 부를 사용할 수 있습니다.
Introduction
암과 같은 병 리 핵 모양 및 구조1,2, 일반적으로 동반 된다 핵3,4의 ‘연’을 변경 포함 됩니다. 기계적 변형에 저항을 핵은 고립 된 핵5에 힘을 적용 하 여 일반적으로 특징 되었습니다.
셀에 핵 분자로 링커의 Nucleoskeleton와 골격 (링컨) 복잡 한6,7,,89골격에 연결 됩니다. 그 결과, 골격과, 세포 층 유착, 세포 외 매트릭스를 통해 핵 기계적으로 통합 되었습니다. 기계적으로 부착 세포 안에 핵을 프로 빙이 기계적 통합에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 살아있는 세포에서 핵을 조작 하는 메서드는 micropipette 포부10,11및 원자 힘 현미경 검사 법12,,1314있습니다. 우리는 최근 생활 부착 셀15에 핵에 직접 기계적인 힘을 적용 하는 직접 힘 프로브 (DFP)를 설명 합니다.
여기, 우리가 일반적으로 알려진된, 나노 기계적 힘을 부착 셀에서 핵 직접 적용할 현미경 시설에서 사용할 수 있는 microinjection 시스템을 사용 하기 위한 절차를 설명 합니다. Femtotip (0.5 µ m 직경 micropipette 팁) 탑재 하 고 튜브에 의해 microinjection 시스템에 연결 된. 때까지 핵 표면에 인접 한 문화 접시의 표면에 상대적으로 45 ° 각도로 위치 팁은 낮 췄 다. 튜브 분리 그리고 핵 표면에 부정적인 흡입 압력을 만들고 물개 micropipette 팁 핵 표면에 대 한 분위기에 열입니다. Micropipette 팁의 번역을 통해 핵 변형 이며 결국 (적용 되는 힘의 크기), 따라는 micropipette에서 분리. 이 분리는 micropipette에 의해 적용 되는 흡입 힘 동등 하 게 복원 (저항) 세력, 핵 및 셀에 의해 발휘 될 때 발생 합니다. 핵의 변위를 측정 하 여 분석을 수행할 수 있습니다 길이 변형 (공식 1), 또는 지역 스트레인 (그림 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
어느 고립 된 핵 (핵은 골격에서 분리)를 필요로 하기 때문에 micropipette 포부16, 등 최신 방법에 대 한 도전 이다 골격 가진 핵의 기계적 통합 측정 또는 일시 중단 된 셀 (견인 힘, 같은 세포 외 세력 있는 결 석)에 핵. 강제로 막17,18; 세포 점착에 biaxial 긴장을 적용 하 여 핵에 적용 된 그러나,이 기술은 핵에 힘 불명 하다는 사실에 의해 제…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH R01 EB014869에 의해 지원 되었다.
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
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