שמירה על תרבויות ביולוגי מדידה ביטוי גנים ב Aphis nerii: מערכת Non-מודל עבור אינטראקציות צמח-חרק
Summary
מימדיה Aphis nerii והצנרות על הגן מאוד צמחים ממשפחת dogbane (Apocyanaceae), ומספק הזדמנויות רבות ללמוד אינטראקציות צמח-חרקים. כאן, אנו מציגים סדרת פרוטוקולים עבור שמירה על צמח, כנימות עלה תרבויות, ואת הדור ניתוח של מולקולרית ונתונים – omic עבור nerii א.
Abstract
כנימות הן ניסיוניות מעולה למגוון רחב של שאלות ביולוגיות החל את האבולוציה של symbioses ופיתוח של polyphenisms לשאלות המקיפים של החרק אינטראקציות עם צמחים פונדקאים שלהם. גנומית משאבים זמינים עבור מספר מינים כנימות עלה, עם ההתקדמות רצף הדור הבא, מחקרים transcriptomic להיות מורחבות כדי אורגניזמים שאינם-דגם חסרי הגנום. יתר על כן, תרבויות כנימות עלה יכול להיות שנאספו מהשטח וגדלתי במעבדה לשימוש בניסויים organismal מולקולרית, כדי לגשר על הפער בין מחקרים אקולוגיים גנטי. בפעם האחרונה, כנימות רבים יכול להישמר במעבדה על צמחים פונדקאים המועדפת שלהם במחזורי החיים הנצחי, parthenogenic המאפשר השוואות של asexually מתרבה אחרים. Aphis nerii, מימדיה לבנבן-הרדוף מספק מודל אחד כזה ללמוד אינטראקציות חרקים עם צמחים רעילים באמצעות ניסויים הן organismal והן מולקולרית. שיטות דור ותחזוקה של תרבויות החממה, מעבדה, עקירות DNA ו- RNA, ניתוח microsatellite, דה נובו transcriptome הרכבה, ביאור, transcriptome דיפרנציאלית הביטוי צמח, כנימות עלה ניתוח ואימות qPCR של גנים ביטוי באופן שונה המתוארים הינם שנדונו כאן.
Introduction
כנימות הן חרקים קטנים, hemimetabolous ליישב על משפחות צמחים מגוונים ברחבי העולם. הם ייחודי עבור מספר תכונות, ביותר ובמיוחד שלהם מחזורי החיים מורכבים המערבים רביית בתולים מחזורית polyphenisms דיסקרטית, ואת שלהם symbioses תזונתי פעל עם endosymbionts בקטריאלי או שמרים לספק חומרים מזינים חסרים הדיאטה שלהם של הצמח sap1. בעוד רוב הכנימות הם מומחים הצמח הפונדקאי, מינים מסוימים עובדים כלליים הם מזיקים חשוב חיתוך, גרימת נזק כלכלי ניכר על היבול גם ישירות או באמצעות גורמי מחלה, וירוסים הם וקטור2. הפרסום של הגנום כנימות עלה הראשון בשנת 2010 מימדיה אפונה Acyrthosiphon אפון3, מסומן ציון דרך חשוב בחקר הביולוגיה כנימות עלה משום שסיפקה את המשאבים גנומית לשאלות המיעון על החרק עיבודים ל אורח החיים אוכלי עשב, כולל אלה שעשויים להוביל אסטרטגיות שליטה טובה יותר4. מאז, צברו משאבים גנומית נוספים עם הפרסום של הגנום מוערת על סויה כנימות עלה Aphis glycines5ומשאבים הגנום כולו מהעדכונים הזמינים עבור שלוש-כנימות עלה עוד מינים (המידע cerasi (כנימות עלה דובדבן שחור), המידע שיפורט להלן מתייחס (כנימות עלה אפרסק-תפוחי אדמה), Rhopalosiphum padi (כנימות עלה ענביה-שיבולת שועל)6. ערך דה נובו transcriptomic משאבים זמינים גם עבור מספר מינים אחרים כנימות עלה (e.g.,Aphis gossypii (כותנה כנימות עלה)7, Sitobion avenae (כנימות עלה תבואה)8, Cinara pinitabulaeformis (כנימות עלה אורן)9, Aphis nerii (כנימות עלה לבנבן-הרדוף)10).
כנימות עשו גם תרומות מתמשך להבנה שלנו את האינטראקציות צמח-חרק ואקולוגיה של חיי הצמחים11. תחום אחד שבו כנימות לתרומות חשוב במיוחד הוא בהבנתנו. אקולוגיה כימית של אינטראקציות צמח המארח. עיבודים אקספרס מגוונות חרקים אוכלי עשב עבור להתגבר על ההגנות צמח, וחלק אפילו לצרף צמח ההגנות שלהם ליהנות12,13,14. לדוגמה, מימדיה לבנבן-הרדוף Aphis nerii, הוא בהיר צהוב, פולשני כנימות עלה, נמצאו באזורים אקלים ואזורים טרופיים ברחבי העולם זה והצנרות על צמחים ממשפחת לבנבן (הרדופיים). צמחים ממשפחת הרדופיים התפתחו ההגנות כימיים מגוונים, לרבות latex חלבי גליקוסיד הידועה בשם cardenolides, אשר מאגד המוביל הקטיון Na, K-ATPase ומהוות deterrents יעיל ומתוכנן אוכלי עשב15, 16. לבנבן מומחים לבטא מצבים שונים של התנגדות cardenolides, חלקם באופן סלקטיבי או פסיבי לצבור או לשנות cardenolides ברקמות שלהם כאמצעי להרתיע טריפה או הטבות אחרות17. Nerii א נחשב לבודד cardenolides בדרך זו, אף מנגנוני והיתרונות פונקציונלי לא ברור10,18.
בהינתן המשאבים גנומית בהישג יד, א nerii מספק מדגם ניסיוני מעולה לצורך המחקר של המנגנונים המולקולריים והגנטיים מעורבת ביחסי הגומלין כימותרפיה-אקולוגית בין צמחים פונדקאים רעילים מומחה שלהם אוכלי עשב. ראוי לציין כי, בעוד שבחלקם המחקרים המוקדמים של א nerii התמקדו פחמיות של cardenolides19, מאז, מחקרים של nerii א סיפקו תובנות לתוך מערך רחב של שאלות אבולוציונית וגם אקולוגית, כולל המבנה הגנטי של חרקים פולשנית20 והגומלין בין רגולציה מלמטה ולא מלמעלה על צפיפות הרביוור21. Nerii א ולכן מועמד טוב בתור מודל ניסיוני עבור מערך רחב במיוחד של מחקרים של אינטראקציות חרק-צמח. קריטי להצלחה של כל מחקר עם nerii א הוא התרבות זהיר של כנימות עלה אוכלוסיות, כולל התרבות של צמחים אשר תלויים הכנימות, וכן של דור יעילה של נתונים באיכות גבוהה – omic. המטרה שלנו היא להנחות את הקורא דרך שניהם. המפורטות להלן הן שיטות דור ותחזוקה של התרבויות צמח, כנימות עלה החממה, מעבדה, DNA, RNA עקירות, ניתוח microsatellite, דה נובו transcriptome הרכבה, ביאור, transcriptome ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, ואימות qPCR באופן שונה באה לידי ביטוי גנים. בעוד שיטות אלה כתובות א neriiculturing כללי, חילוץ, שיטות ניתוח יכול להרחיב מגוון מינים כנימות עלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה זמן הוכר כי aposematic nerii א יכולה לספק תובנות דפוסים ומנגנונים של התנגדות צמח ההגנות ו פחמיות כימי במיוחד18,37. לאחרונה הופיעו מספר משאבים גנומית nerii א10, המציע הזדמנויות חדש אקולוגי ופונקציונליים גנומית מחקרים המשתמשים nerii א כמודל. א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות מישל הירח (אוניברסיטת ואנדרבילט) לקבלת סיוע עם הצילום. אוניברסיטת ואנדרבילט סיפק תמיכה ברשות הפלסטינית, SSLB נתמך על ידי DGE-1445197.
Materials
| Sun Gro Fafard Germination Mix | Hummert International | 10-0952-2 | |
| Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix | Hummert International | 10-0951-2 | |
| 2x 4" Round Standard Pot | Anderson Pots | 1503 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0701 | |
| Trizol | ThermoFisher Scientific | 15596026 | |
| SuperScript® III First-Strand Synthesis kit | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4367659 |
References
- Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
- Dixon, A. F. G. . Aphid Ecology: An Optimization Approach. , (1985).
- Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313 (2010).
- Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
- Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
- Li, Z. -. Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180 (2013).
- Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
- Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
- Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
- Dixon, A. F. G. . Insect Herbivore-Host Dynamics. , (2005).
- Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
- Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
- Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
- Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
- Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect’s perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
- Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
- Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems – a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
- Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
- Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid ‘superclone’: extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524 (2011).
- Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
- Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
- Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
- Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, 279-285 (2016).
- The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
- Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
- Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31 (2014).
- Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
- Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
- Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
- Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
- Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417 (2010).
