Behoud van de biologische culturen en meten van de genexpressie in Aphis Oleanderpijlstaart: een Non-modelsysteem voor Plant-insect interacties
Summary
De bladluis Aphis Oleanderpijlstaart koloniseert op zeer verdedigd planten uit de familie van de onderfamilie (Apocyanaceae) en biedt tal van mogelijkheden om te studeren plant-insect interacties. Hier presenteren we een reeks van protocollen voor het onderhoud van de installaties en de bladluis culturen, en de generatie en de analyse van moleculaire en – dienst gegevens voor A. Oleanderpijlstaart.
Abstract
Bladluizen zijn uitstekende experimentele modellen voor een verscheidenheid van biologische vragen variërend van de evolutie van symbiose en de ontwikkeling van polyphenisms tot vragen rond insect interacties met hun waardplanten. Genomic middelen zijn beschikbaar voor verschillende soorten van de bladluis, en met vooruitgang in de volgorde van de volgende generatie, transcriptomic studies worden uitgebreid tot niet-modelorganismen dat het gebrek aan genomen. Bovendien kunnen de bladluis culturen worden verzameld uit het veld en gekweekt in het laboratorium voor het gebruik in organisch en moleculaire experimenten om de kloof tussen ecologische en genetische studies. Laatst, veel bladluizen kunnen worden gehandhaafd in het laboratorium op hun voorkeur gastheerplanten in eeuwigdurende, parthenogenic levenscycli waardoor vergelijkingen aardlingen reproduceren genotypen. Aphis Oleanderpijlstaart, de Kroontjeskruid-oleander bladluis, biedt een dergelijk model om te studeren insect interacties met giftige planten met behulp van zowel organisch als moleculaire experimenten. Methoden voor het genereren en het onderhoud van de installaties en de bladluis culturen in de serre en laboratorium, DNA en RNA extracties, microsatelliet analyse, DOVO transcriptome assemblage en aantekening, transcriptome differentiële expressie analyse en qPCR verificatie van differentially uitgedrukte genen zijn geschetst en hier besproken.
Introduction
Bladluizen zijn kleine, hemimetabolous insecten die op uiteenlopende plantenfamilies wereldwijd koloniseren. Ze zijn meest onderscheidende voor verschillende functies, met name complexe productlevenscyclus met cyclische parthenogenese en discrete polyphenisms, en hun obligate voeding symbiose met bacteriën of de gist endosymbionten die voedingsstoffen ontbreekt te verstrekken hun dieet van plant sap1. Terwijl de meeste bladluizen gastheer plant specialisten zijn, sommige soorten generalist zijn belangrijk gewas plagen, toebrengen van aanzienlijke economische schade op gewassen hetzij rechtstreeks of via de ziektekiemen en virussen zij2vector. De publicatie van het eerste bladluis genoom in 2010, de erwt bladluis Acyrthosiphon pisum3, een belangrijke mijlpaal in de studie van biologie van de bladluis gemarkeerd omdat daarin de genomic middelen voorzien in aanpak vragen over het insect aanpassingen aan de herbivore leefstijlen, waaronder bronnen die tot een beter beheer strategieën4 leiden kunnen. Sinds die tijd, hebben extra genomic middelen opgebouwd met de publicatie van een geannoteerde genoom voor de soja bladluis Aphis glycines5en -openbaar hele genoom bronnen voor een andere drie-bladluis soort (groene cerasi (black cherry bladluis), Groene perzikluis (perzik-aardappel bladluis), Rhopalosiphum padi (gewone vogelkers-haver bladluis)6. Waardevolle DOVO transcriptomic bronnen zijn beschikbaar alsook voor een aantal andere soorten bladluis (e.g.,Aphis gossypii (katoen bladluis)7, Sitobion avenae (graan bladluis)8, Cinara pinitabulaeformis (pine bladluis)9, Aphis Oleanderpijlstaart (Kroontjeskruid-oleander bladluis)10).
Bladluizen heb ook blijvende bijdragen aan ons begrip van de plant-insect interacties en de ecologie van het leven op planten11. Een gebied waar de bladluizen bijzonder belangrijke bijdrage hebben geleverd is in ons begrip van de chemische ecologie van de gastheer plant interacties. Plantenetende insecten uiten diverse aanpassingen voordeel voor overwinnen plant verdediging, en sommige zelfs plant verdediging voor hun eigen coöpteren12,13,14. Bijvoorbeeld, is de Kroontjeskruid-oleander bladluis, Aphis Oleanderpijlstaart, een fel geel, invasieve bladluis gevonden in gematigde en tropische gebieden wereldwijd die op planten uit de familie Kroontjeskruid (maagdenpalmfamilie koloniseert). Planten uit de familie maagdenpalmfamilie geëvolueerd verschillende chemische verdediging, met inbegrip van melkachtig latex en cardiale glycosiden bekend als cardenolides, die de vervoerder catie Na, K-ATPase binden en doeltreffend afschrikmiddel dienen tot generalist herbivoren15, 16. Kroontjeskruid specialisten express verschillende modi bestandheid tegen cardenolides en sommige selectief of passief accumuleren of wijzigen van cardenolides in hun weefsels als een middel om af te schrikken van predatie of voor andere voordelen17. A. Oleanderpijlstaart wordt gedacht aan het sekwestreren cardenolides op deze manier, hoewel de mechanismen en functionele voordelen onduidelijk10,18 blijven.
Gezien de genomic middelen bij de hand, geeft A. Oleanderpijlstaart een uitstekend experimenteel model voor de studie van de moleculaire en genetische mechanismen die betrokken zijn bij de chemo-ecologische interacties tussen toxische gastheerplanten en hun specialist herbivoren. Het is vermeldenswaard dat, terwijl enkele van de vroegste studies van A. Oleanderpijlstaart gericht op reductie van cardenolides19, sinds die tijd, studies van A. Oleanderpijlstaart inzicht in een breed scala van evolutionaire en ecologische aangelegenheden verstrekt hebben, met inbegrip van de genetische structuur van invasieve insecten20 en de wisselwerking tussen de verordening van onderop en de top-down op de herbivoor dichtheid21. A. Oleanderpijlstaart is dus een goede kandidaat als een experimenteel model voor een bijzonder breed scala van studies van de plant-insect interacties. Kritiek voor het succes van een studie met A. Oleanderpijlstaart is de zorgvuldige cultuur van bladluis populaties, waarin de cultuur van planten waarvan de bladluizen afhankelijk zijn, evenals een efficiënte generatie van hoge kwaliteit – dienst gegevens. Ons doel is om te leiden de lezer door beide. Hieronder zijn methoden voor het genereren en het onderhoud van de installaties en bladluis culturen in de broeikasgassen en laboratorium, DNA en RNA extracties, microsatelliet analyse, DOVO transcriptome vergadering en aantekening, transcriptome differentiële expressie analyse en qPCR verificatie van differentially uitgedrukte genen. Terwijl deze methoden zijn geschreven voor A. Oleanderpijlstaart, kunnen het algemene kweken, extractie en analyse methoden vergroot worden tot een verscheidenheid van soorten van de bladluis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het heeft lang erkend dat de aposematic A. Oleanderpijlstaart verwerven in de patronen en mechanismen van resistentie aan de verdediging van de plant en met name chemische sekwester18,37 inzicht kunt. Een aantal van de genomic middelen opgedoken onlangs voor A. Oleanderpijlstaart10, biedt nieuwe mogelijkheden voor ecologische en functionele genomic studies die A. Oleanderpijlstaart als een model gebruiken. We sch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Michelle Moon (Vanderbilt University) voor hulp bij fotografie. Vanderbilt University verstrekt steun aan PA en SSLB wordt ondersteund door DGE-1445197.
Materials
| Sun Gro Fafard Germination Mix | Hummert International | 10-0952-2 | |
| Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix | Hummert International | 10-0951-2 | |
| 2x 4" Round Standard Pot | Anderson Pots | 1503 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0701 | |
| Trizol | ThermoFisher Scientific | 15596026 | |
| SuperScript® III First-Strand Synthesis kit | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4367659 |
References
- Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
- Dixon, A. F. G. . Aphid Ecology: An Optimization Approach. , (1985).
- Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313 (2010).
- Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
- Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
- Li, Z. -. Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180 (2013).
- Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
- Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
- Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
- Dixon, A. F. G. . Insect Herbivore-Host Dynamics. , (2005).
- Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
- Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
- Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
- Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
- Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect’s perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
- Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
- Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems – a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
- Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
- Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid ‘superclone’: extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524 (2011).
- Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
- Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
- Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
- Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, 279-285 (2016).
- The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
- Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
- Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31 (2014).
- Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
- Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
- Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
- Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
- Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417 (2010).
