Dosage spectrophotométrique du Phycobiliprotein en cyanobactérie Synechocystis
Summary
Nous présentons ici un protocole pour déterminer quantitativement le contenu de phycobiliprotein dans la cyanobactérie Synechocystis en utilisant une méthode spectrophotométrique. La procédure d’extraction a été appliquée avec succès à d’autres souches de cyanobactéries et les algues ; Toutefois, en raison des variations dans les spectres d’absorption de pigment, il est nécessaire de tester les équations spectrophotométriques pour chaque souche individuellement.
Abstract
Il s’agit d’un protocole simple pour la détermination quantitative de la teneur en phycobiliprotein dans la cyanobactérie modèle Synechocystis. Phycobiliprotéines sont les éléments les plus importants des phycobilisomes, les antennes de lumière majeurs chez les cyanobactéries et plusieurs taxons d’algues. Les phycobilisomes de Synechocystis contiennent deux phycobiliprotéines : phycocyanine et allophycocyanin. Ce protocole décrit une simple, efficace et une méthode fiable pour la détermination quantitative de phycocyanine et allophycocyanin dans cette cyanobactérie modèle. Nous avons comparé plusieurs méthodes d’extraction de phycobiliprotein et de dosage spectrophotométrique. La procédure d’extraction tel que décrit dans le présent protocole a été appliquée avec succès à d’autres souches de cyanobactéries comme sp de Spirulina SP., Synechococcuselongatus, Cyanothece ., Arthrospira sp., et Nostoc SP., aussi bien quant à l’algue rouge Porphyridium cruentum. Cependant, les coefficients d’extinction des phycobiliprotéines spécifiques des différents taxons peuvent différer et il est donc recommandé de valider la méthode de dosage spectrophotométrique pour chaque souche unique individuellement. Le protocole exige peu de temps et peut être effectué dans un laboratoire de sciences de la vie standard car il nécessite des équipements standard uniquement.
Introduction
fPhycobiliproteins sont des complexes de pigment-protéine soluble dans l’eau qui représentent les principaux éléments des antennes chez les procaryotes cyanobactéries (cyanophytes) lumière et plusieurs taxons eucaryotes (Glaucophyta, Rhodophyta et Cryptophyta)1. Ils se produisent principalement sous forme de complexes supramoléculaires appelés phycobilisomes et ils sont généralement attachés à la surface des membranes photosynthétiques côté stromal, à l’exception de Cryptophyta, où les phycobiliprotéines sont localisées dans le thylakoïde lumen2. Quatre types de phycobiliprotéines ont été identifiées jusqu’à date : l’allophycocyanin de base et le périphérique de phycocyanine, phycoérythrine et phycoerythrocyanin1. Les principaux complexes de lumière, phycobilisomes représentent un des facteurs essentiels de la productivité des cultures masse algues et cyanobactéries. Il a été démontré que cette troncature phycobilisomes peut améliorer l’accumulation de la biomasse sous forte lumière3. En revanche, éclairement faible ou modeste, la troncature de l’antenne a conduit à des taux de croissance et d’accumulation de biomasse réduction3,4. Phycobiliprotéines sont commercialement utilisées comme colorants alimentaires, produits pharmaceutiques et les additifs alimentaires, dans l’industrie cosmétique et comme la fluorescence des sondes avec des applications en cytométrie en flux, fluorescents immuno-essais et microscopie de fluorescence5.
Ce protocole met l’accent sur la détermination quantitative des phycobiliprotéines dans la cyanobactérie modèle Synechocystis. Les cyanobactéries sont les premiers autotrophes photosynthétiques oxygénique ; ils ont été formant la biosphère de la terre depuis plus de 2,4 milliards d’années6. Ils jouent un rôle crucial dans les cycles biogéochimiques mondiaux d’azote, carbone, d’oxygène et d’autres éléments. Chez les cyanobactéries, une souche unicellulaire Synechocystis acquis une position unique puisqu’il s’agissait de la première cyanobactérie avec tout le génome séquencé7,8, il est naturellement transformable par l’ADN exogène9, et Il réalise une croissance stable et relativement rapide,10,11. Synechocystis, la composante de base antenne, allophycocyanin, est associée à des protéines membranaires intrinsèques, en la phycocyanine ci-joint est situé à la périphérie de membrane des thylakoïdes.
Plusieurs méthodes d’extraction de phycobiliprotein et de quantification sont comparées dans ce protocole. La procédure d’extraction finale a été appliquée avec succès aux Synechocystis, ainsi qu’à d’autres souches de cyanobactéries, y compris les sp de Spirulina SP., Synechococcuselongatus, Cyanothece ., Arthrospira SP.et Nostoc SP. et il a été également avec succès appliqués aux algues rouges Porphyridium cruentum. Donc, la méthode développée dans le présent protocole peut être considérée comme une méthode universelle pour l’extraction de phycobiliprotein. Même si certaines des méthodes éprouvées d’extraction a entraîné des rendements plus élevés de protéines totales, l’ici visées procédure d’extraction pourvu le phycobiliprotein plus haut rendements ainsi que la plus faible teneur d’un résidu de la chlorophylle dans la extrait de phycobiliprotein. Réduire la teneur en chlorophylle a a été essentielle à la phycocyanine correcte et allophycocyanin dosage spectrophotométrique.
Les spectres d’absorption de phycobiliprotein peut varier considérablement entre les différentes algues et cyanobactéries espèces12,13,14,15,16,17 et même parmi plusieurs souches d’un genre de cyanobactéries unique18. Par conséquent, les longueurs d’onde spécifiques et les coefficients d’absorption tel qu’utilisé pour la détermination de la phycocyanine et allophycocyanin dans Synechocystis ne sont pas généralement applicables à d’autres souches. En outre, Synechocystis ne contient pas de phycoérythrine et phycoerythrocyanin que l’on retrouve dans d’autres algues et cyanobactéries. Aux fins de la détermination des phycobiliprotéines chez les souches autres que Synechocystis, il est recommandé d’évaluer individuellement les équations spectrophotométriques pour chaque souche.
Même si le protocole contient deux étapes plus longues (du jour au lendemain la lyophilisation des granules cellulaires et extraction de protéine 1 heure), le temps de travail total pour la quantification des phycobiliprotéines n’excède pas 2 heures.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode simple, rapide et reproductible pour la quantification de la teneur en phycobiliprotein dans la cyanobactérie modèle Synechocystis. Plusieurs méthodes d’homogénéisation de la cellule, d’extraction de protéine et quantification de phycocyanine et allophycocyanin sont comparés, et le protocole final représente une combinaison des mesures optimales de chaque procédure unique. Comme les données représentatives, le contenu des phycobiliprotéines a été quantifié dan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le protocole a été adopté dans une précédente publication11. T. Z., Ch. D. et J. Č. appuyés par le ministère de l’éducation, de jeunesse et de Sports de la République tchèque au sein du Programme National de développement durable j’ai (NPU j’ai), accorder le numéro LO1415. J. Č. était également soutenue par GA CR, numéro 18-24397S de la licence. Accès aux outils ou autres installations était soutenue par l’infrastructure de recherche tchèque pour la biologie des systèmes C4SYS (aucune LM2015055 du projet). M. A. S. a été financée par une subvention de la Fondation de la Science russe [n ° 14-14-00904].
Materials
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
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