الكهربية كل خلية من خلايا Enterochromaffin موريني مثقف الأولية
Summary
خلايا Enterochromaffin (EC) تضم مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا الظهارية المعدية المعوية. خلايا الجماعة الأوروبية منفعل كهربائياً وإطلاق السيروتونين، بعد صعوبات في استزراع وتحديد خلايا الجماعة الأوروبية محدودة الدراسات الفسيولوجية. الطريقة المعروضة هنا تؤسس نموذج ثقافة الأولية قابلة للفحص لخلايا الجماعة الأوروبية الكهربية.
Abstract
وتشكل خلايا Enterochromaffin (الجماعة الأوروبية) في الظهارة (غي) الجهاز الهضمي يتدنى أكبر من الخلايا انتيروندوكريني. كخلايا حسية متخصصة، بمعنى المحفزات لومينال خلايا الجماعة الأوروبية وتحويلها إلى أحداث إطلاق السيروتونين (5-هيروكسيتريبتاميني، 5-HT). ومع ذلك، هو غير مفهومة الكهربية لهذه الخلايا لأنها صعبة للثقافة وتحديد. الطريقة التي عرضت في هذه الورقة الخطوط العريضة الأولية EC خلية الثقافات الأمثل للكهربية خلية مفردة. هذا البروتوكول يستخدم مراسل المعدلة وراثيا بروتين فلوري سماوي (CFP) لتحديد خلايا الجماعة الأوروبية الماوس في الثقافات الابتدائية المختلطة، النهوض بالنهج المتبع للحصول على تسجيلات عالية الجودة الكهربية الخلية كلها في أوضاع المشبك الجهد والحالية.
Introduction
الظهارة (غي) الجهاز الهضمي مجتمع متنوع يتكون من عدة أنواع من الخلايا. الخلايا انتيروندوكريني تضم حوالي 1% من جميع الخلايا الظهارية، وخلايا enterochromaffin (المفوضية الأوروبية) هي أكبر انتيروندوكريني خلية السكان1. وتظهر الدراسات الأخيرة أن انتيروندوكريني2 و3،EC4 خلايا منفعل كهربائياً. ونحن مهتمون بفهم الجماعة الأوروبية الرئيسية الخلية الكهربية. وهكذا، كان الغرض من هذه الدراسة إنشاء الأساسي الثقافات الخلية EC الأمثل للكهربية الخلية كلها.
خلية الجماعة الأوروبية القائمة عادة ما يتم إنشاء الأسطر التي تنتج وتفرز 5-HT (مثلاً، قجب-15، بون6، كرج-17) وقد استخدمت لدراسة الكهربية5،8 من خلد الورمية الأنسجة. أن المعلومات المكتسبة من هذه الخطوط الخلية القيمة5،8، فالدراسات الكهربية الخلية الأولية ضرورية لفهم فيزيولوجيا الخلية المفوضية الأوروبية بشكل صحيح. يتطلب الكهربية لخلايا الجماعة الأوروبية أولية بالعزلة وثقافة واحدة من الخلايا الظهارية، الذي كان محدودا باستمرارية انخفاض الثقافات الظهارية.
يعتمد الأسلوب الثقافة المقدمة في هذه الدراسة على الفئران المحورة وراثيا مع خلايا الجماعة الأوروبية المسماة فلوريسسينتلي، مثل Tph1-الحراجية المعتمدة9، المستخدمة في هذه الدراسة. الأسلوب الذي يحسن ابتدائية مختلطة الثقافات الظهارية وضعت سابقا2،10 لخلية مفردة الكهربية3. استخدام تركيبات التربسين/يدتا بالإضافة إلى A كولاجيناز أو يدتا و DTT الهضم الأنزيمي الأساليب السابقة ويستخدم كثافة التدرجات إلى عزل على وجه التحديد والثقافة خنزير غينيا11 والفئران خلايا الجماعة الأوروبية12. في الآونة الأخيرة، كانت ولدت أورجانويدس المعوية وعطلت ميكانيكيا للتسجيلات الكهربية4. الثقافات باستخدام هذه الأساليب مناسبة تماما السيروتونين الإفراج عن التجارب، وتحليل RT-قبكر، وأنه، في حين أنها يمكن أن تستخدم للكهربية، تعتمد على نجاح الجيل أورجانويد مضيعة للوقت، وكثافة التدرجات تحديد خلايا الجماعة الأوروبية، الآثار المدمرة التي تخلفها الخلوية التربسين ويدتا. على النقيض من ذلك، البروتوكول الموصوفة هنا يحسن العلاج الأنزيمي والميكانيكية، ويحسن ظروف تثقيف، ويبسط إجراءات لإنتاج خلايا الجماعة الأوروبية واحد وصحية مناسبة للمعايير الخلوية العالية اللازمة للكهربية.
سوف تكون هذه الطريقة مفيدة للعلماء الذين يريدون العمل في خلايا الجماعة الأوروبية الأولية في الثقافات المختلطة بدلاً من الثقافات مخلدة وتريد التحقيق الكهربية للخلايا المفردة. ومع ذلك، قد يكون أقل ملاءمة لدراسة السكان الخلية التي تحتاج الثقافات الفرز أو طويلة الأجل تتطلب بقاء ح 72 الماضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
فهم تماما وظيفة الخلية المفوضية الأوروبية يتطلب أسلوب ثقافة الأولية عالية الجودة لإنشاء خلايا للكهربية الخلية كلها. الثقافات الأولية ظهارة غي تقليديا صعباً بسبب بقاء منخفضة. التخفيف من حدة هذه العوامل المؤثرة الأخرى، الأسلوب الحالي غلة الثقافات المفرد EC الخلايا من الأمعاء الصغيرة أو ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون السيدة ليندسي Busby للمساعدة الإدارية والسيد روبرت هيت من “مايو كلينيك عيادة شعبة الهندسة” لتصميم وطباعة 3D لإدراج طبق الثقافة. هذا العمل كان يدعمها K08 المعاهد الوطنية للصحة لأب (DK106456) والطيار ومنحة الجدوى لأب من مركز عيادة مايو كلينيك “الخلية الإشارات” في أمراض الجهاز الهضمي (P30DK084567 المعاهد الوطنية للصحة) وعام 2015 جاسترونتيرولوجيكال رابطة البحوث الباحث جائزة الأمريكية (RSA أغا) إلى آب، والمعاهد الوطنية للصحة R01 لفرنك غيني (DK52766).
Materials
| High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
| Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
| 100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
References
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The “normal” endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, 1081-1093 (2011).
- Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
- Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
- Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
- Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
- Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
- Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
- Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
- Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, 5959-5975 (2013).
- Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
