Analyser la taille, la forme et la directionnalité des réseaux des Astrocytes induits
Summary
Nous présentons ici un protocole afin d’évaluer l’organisation de réseaux astrocytaires. La méthode décrite minimise la partialité de fournir des mesures descriptives de ces réseaux tels que le nombre d’éléments, taille, zone et la position dans un noyau. Anisotropie est évaluée par une analyse vectorielle.
Abstract
Il est devenu de plus en plus évident que les astrocytes modulent la fonction neuronale non seulement au niveau synaptique et unicellulaires, mais aussi au niveau du réseau. Les astrocytes sont fortement reliés entre eux par l’intermédiaire de jonctions lacunaires et couplage par ces carrefours est dynamique et très réglementé. Un nouveau concept est que les fonctions astrocytaires sont spécialisées et adaptées aux fonctions du circuit neuronal auxquels ils sont associés. Par conséquent, méthodes pour mesurer les différents paramètres des réseaux astrocytaires sont nécessaires pour mieux décrire les règles relatives à leur communication et de couplage et de mieux comprendre leurs fonctions.
Ici, en utilisant le logiciel d’analyse de l’image (par exemple., ImageJFIJI), les auteurs décrivent une méthode pour analyser les images confocales de réseaux astrocytaires révélées par couplage colorant. Ces méthodes permettent 1) une détection automatisée et non biaisée des cellules marquées, 2) calcul de la taille du réseau, 3) le calcul de l’orientation préférentielle de colorant réparties au sein du réseau et 4) repositionnement du réseau dans la zone d’intérêt .
Cette analyse peut être utilisée pour caractériser les réseaux astrocytaires d’un secteur particulier, comparer les réseaux des différents domaines liés aux différentes fonctions ou comparer les réseaux obtenus dans des conditions différentes qui ont des effets différents sur le couplage. Ces observations peuvent conduire à des considérations fonctionnelles importantes. Par exemple, nous analysons les astrocytes réseaux du noyau trigéminal, où nous avons déjà montré que le couplage astrocytaires est essentiel pour la capacité des neurones à changer leurs habitudes de tir de tonique à la rupture rythmique1. En mesurant la taille, le confinement et l’orientation préférentielle des réseaux astrocytaires dans ce noyau, nous pouvons bâtir des hypothèses sur des domaines fonctionnels qu’elles circonscrivent. Plusieurs études suggèrent que plusieurs autres régions du cerveau, y compris le cortex de baril latérale supérieure et d’olive, glomérules olfactifs, noyaux sensoriels dans le thalamus et le cortex visuel, pour n’en nommer que quelques-uns, peuvent bénéficier d’une analyse similaire.
Introduction
De nombreuses études ont décrit comment le dialogue neuron-astrocyte à un niveau subcellulaire ou synaptic peut avoir des implications dans les fonctions neuronales et la transmission synaptique. Il est bien établi que les astrocytes sont sensibles aux entourant l’activité neuronale ; en fait, ils ont des récepteurs de nombreux neurotransmetteurs dont glutamate, GABA, acétylcholine et ATP (voir commentaires déjà publiés,2,3,4). En retour, astrocytaires traite les deux éléments synaptiques forte et influence l’activité neuronale là que sur les sites extrasynaptic par régulation de l’homéostasie ionique extracellulaire et libérant plusieurs facteurs ou émetteurs tels que le glutamate, la D-sérine et ATP 5 , 6 , 7.
L’idée que les astrocytes peuvent également moduler fonction neuronale au niveau du réseau a vu le jour, avec la preuve que les astrocytes couplage est réglementée dans l’espace et correspond à une segmentation neuronale dans des zones caractérisées par une claire anatomiques cloisonnement (comme les zones avec des représentations sensorielles), indiquant que les astrocytes seront accoupler au autres astrocytes desservant la même fonction, plutôt que seulement ceux qui sont à proximité. Dans l’olive supérieure latérale, par exemple, réseaux plus astrocytaires sont orientées perpendiculairement à l’ axe de tonotopique8, alors que dans les glomérules de cortex ou olfactoty de Canon, communication entre astrocytes est beaucoup plus forte au sein des barils ou des glomérules et le plus faible entre adjacentes ceux9,10. Dans les deux cas, les réseaux astrocytaires sont orientés vers le Centre des glomérules ou tonneau9,10.
Nous avons montré récemment qu’activité astrocytaires l’module tir neuronale en diminuant la concentration extracellulaire Ca2 + ([Ca2 +]e), probablement par le biais de la sortie de S100β, un Ca2 +-binding protein11. Cet effet, qui a été démontré dans une population de neurones trigéminaux rhythmogenic dans la partie dorsale du trijumeau main sensorielle noyau (NVsnpr, semble jouer un rôle important dans la génération de mouvements masticatoires), provient du fait que rythmique tir dans ces neurones dépend un persistant Na+ actuel qui est favorisée par une diminution de [Ca2 +]e11,,12. Rythmique tir dans ces neurones peut être déclenché « physiologiquement » par stimulation de leurs intrants ou diminution artificielle du [Ca2 +]e. Encore, nous avons montré qu’il fallait astrocytaires couplage pour tir rythmique neuronale1. Cela a soulevé la possibilité qu’astrocytaires réseaux peuvent se former des domaines fonctionnels circonscrits où l’activité neuronale peut être synchronisée et coordonnée. Pour évaluer cette hypothèse, il nous fallait tout d’abord élaborer une méthode pour rigoureusement documenter l’organisation de ces réseaux au sein de la NVsnpr.
Des études antérieures sur les réseaux astrocytes ont décrit surtout la mesure de couplage en termes de nombre de cellules, la densité et la zone couverte. Tentatives pour évaluer la forme de réseaux astrocytaires et la direction de colorant-accouplement ont été principalement réalisées en comparant la taille des réseaux le long des deux axes (x et y) dans le baril cortex9, hippocampe13,14, 15, barreloid domaines du thalamus16, latérale supérieure olive8, glomérules olfactifs10et cortex14. Les méthodes décrites ici permettent impartiaux chefs de cellules marquées dans un réseau et une estimation de la superficie qu’ils couvrent. Nous avons développé également des outils pour définir l’orientation préférentielle de couplage au sein d’un réseau et d’évaluer si l’orientation préférentielle est vers le centre du noyau ou dans une autre direction. En comparaison avec les méthodes précédemment utilisées, ce protocole prévoit un moyen de décrire l’organisation et l’orientation des réseaux astrocytaires dans des structures comme le noyau dorsal de sensoriel principal du trijumeau qui n’ont pas un connu clairement anatomique compartimentation. Dans les études susmentionnées, l’orientation du réseau est décrite comme une relation à la forme de la structure elle-même, qui est déjà documentée (par exemple., la barreloid dans le thalamus, barils dans le cortex, couches dans l’hippocampe et le cortex, le glomérules dans le bulbe olfactif, etc.). En outre, l’analyse vectorielle permet pour les comparaisons des orientations révélées dans différentes conditions de couplage. Pour analyser si ces paramètres changés selon la position du réseau au sein du noyau, nous avons aussi développé une méthode pour remplacer chaque réseau en ce qui concerne les limites du noyau. Ces outils peuvent être facilement adaptés à d’autres domaines pour les réseaux d’instruction des cellules couplées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un certain nombre de méthodes électrophysiologiques existe pour évaluer fonctionnelle de couplage entre astrocytes23,24. Cependant, ces méthodes ne fournissent pas d’informations sur la disposition anatomique des réseaux astrocytaires. Un certain nombre d’études ont déjà montré que « colorant ou traceur-couplage », comme le cas ici, se produit seulement en une fraction de couplé des cellules qui sont détectés par des méthodes électrophysiolo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est financé par les instituts de recherche en santé, nombre de subvention : 14392.
Materials
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anhydrous | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 dihydrated | Sigma | C70-500 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| D-gluconic acid potassium salt | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Salt | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Salt | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone disodium salt | Sigma | C4790 | |
| avidin-biotin complex : ABC kit | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xylene | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544A | |
| Microscope slide ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope | Olympus | ||
| 40X water-immersion lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X water-immersion lens | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X water-immersion lens | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Camera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Black and white monitor | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplifier | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Electrophysiology acquisition software | Molecular devices | pClamp 8 | |
| Electrophysiology analysis software | Molecular devices | Clampfit 8 | |
| Imaging analysis software | ImageJFIJI | Open source software. FIJI version including plug in package. | |
| Vector image editor | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Spreadsheet application | Microsoft Office | Excel 2010 |
References
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