Assay высок объём кальция потока для изучения NMDA-рецепторов с чувствительностью к глицин/D-серина и глутамата
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы облегчить изучение NMDA-рецепторов (NMDAR) в большем масштабе и позволить изучение модулирующее влияние малых молекул и их терапевтического применения.
Abstract
N-метил D-аспартат (NMDA) рецепторы (NMDAR), классифицируются как ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ рецепторов и важнейшую роль в учить и память. NMDAR неисправность, выраженные как либо над – или под – activity вызванных мутациями, измененное выражение, торговлей или локализации, может способствовать к многочисленным заболеваниям, особенно в центральной нервной системе. Таким образом понимание биологии рецепторов, а также облегчение открытия соединений и малых молекул имеет решающее значение в продолжающихся усилиях по борьбе с неврологическими заболеваниями. Нынешние подходы к изучению рецептор имеют ограничения, включая низкую пропускную способность, высокая стоимость и невозможность для изучения его функциональные возможности из-за необходимости присутствие блокаторы кальциевых каналов для предотвращения NMDAR-опосредованной Эксайтотоксичность. Кроме того существующие системы пробирного чувствительны к стимуляции от глутамата только и отсутствие чувствительности к стимуляции, глицин, другой сопредседатель лигандом NMDAR. Здесь мы представляем первый на основе плиты пробирного с высок объём мощности для изучения NMDA-рецептора с чувствительностью к совместно лигандов, глутамата и D-Серин/глицина. Этот подход позволяет изучение различных композиций субъединица NMDAR и позволяет функциональные исследования рецептора в глицин и/или глутамат чувствительных режимах. Кроме того этот метод не требуется присутствие ингибиторов во время измерений. Эффекты положительных и отрицательных аллостерический модуляторы могут быть обнаружены с этот assay и известных фармакологии NMDAR была воспроизведена в нашей системе. Эта техника преодолевает ограничения существующих методов и экономически эффективным. Мы считаем, что эта технология будет ускорить открытие терапии для NMDAR-опосредованной патологий.
Introduction
С текущих достижений в области медицины продолжительность жизни возросла значительно; Однако так что имеет распространенность заболеваний, связанных с возрастом. Заболевания центральной нервной системы (ЦНС), таких, как шизофрения, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, среди прочих, не являются исключением и были предполагается увеличить в течение следующего десятилетия1, 2 , 3. неисправности ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ рецепторов, известный как N-метил D-аспартат рецепторы (NMDAR) был связан с болезни Альцгеймера, шизофрении, черепно-мозговой травмы, инсульта, диабета и глаукомы, среди прочего, который гарантирует необходимо изучать их биологии для развития эффективных, Болезнь модифицирующие терапии4,5,6,7.
NMDARs состоят из четырех мономеров или подразделения4,8,9. Структурный состав NMDAR показывает развития и региональной изменчивости в мозг7,10. NMDARs участвуют в синаптической пластичности, познания и генерации ритмов для дыхания и локомоции11,12,13. Как напряжения закрытый канал, это во многом непроводящую на мембранного потенциала покоя (-70 mV) и блокируется магния, чтобы предотвратить дальнейшее проникновение ионов. Канал активируется путем связывания двух лигандов, глутамата и глицина/D-Серин, и одновременное деполяризации в синаптических мембран при посредничестве АМПА рецепторов, другой подкласс ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ рецепторов. Скорость деполяризации удаляет блокировку магния NMDAR, позволяя приток катионов, особенно кальция14,,1516. Несмотря на то, что активация NMDAR имеет важное значение для выживания клетки, чрезмерное активации может привести к ячейке смерти17,18,19 через Эксайтотоксичность. Это, помимо сложного характера рецептора, делает его сложным для выполнения исследования необходимых для разработки эффективных терапевтических методов.
Различные методы были разработаны для изучения NMDAR. Однако каждый из них имеет, сопровождающих предостережений. Например один широко используемый метод — на основе флуоресценции assay который измеряет NMDAR-опосредованной изменения в внутриклеточного кальция в стабильной клеток линии под контролем промотора тетрациклин индуцибельной (тет-на)20. Однако в этой системе, supramaximal концентраций лигандов, которые необходимы и требование, что ингибиторы NMDAR присутствуют во время измерения делает его почти невозможным для обнаружения деятельности конкурентным антагонистом. В других подобных системах выражение функциональных рецепторов вызывает токсичности, требующих блокаторы кальциевых каналов, такие как кетамин21,22 для сохранения культур клеток. Эти блокаторы кальциевых каналов сидеть в ядре рецептора и трудны для того промыть, особенно в формате на основе плиты, так что они мешают функциональных исследований рецептора. Наконец в электрофизиологические измерения например патч зажима, ограниченной пропускной способности, и крупномасштабные исследования являются очень дорогими23. Несмотря на это перечисленных выше систем нечувствительны к стимуляции глицин; Следовательно изучение деятельности глицин зависимой NMDAR становится проблемой.
Здесь мы опишем новый подход для изучения NMDAR, который преодолевает обсудили ограничения. Наша методика основывается на системе выражение бакуловирусы выразить рецептор на функциональных уровнях с оптимальным соотношением подразделений в качестве лишь 16 часов. Кроме того использование бакуловирусы позволяет для простой и комбинаторные подход, который обеспечивает широкую характеристику различных подтипов рекомбинантных NMDAR. В отличие от других анализов этот протокол не требует блокаторы кальциевых каналов из-за использования слабых противников. Сильным преимуществом метода является что после вымывания слабым антагонистом, рецептор чувствителен к модуляции отдельных глицин и глутамата привязки сайтов в дополнение к двойной модуляции глицин/D-серина и глутамата лиганд привязки сайтов. Assay резюмирует известных фармакологии рецептора NMDAR и последствия его известных положительные и отрицательные модуляторов. Наконец поколение этот в vitro сотовой assay преодолевает сотовой токсичности, вызванные чрезмерным кальция приток и позволяет для функциональных исследований рецептора в высок объём моды, которые могут ускорить открытий NMDAR модуляторы в положениях заболеванием.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успех этот assay в значительной степени зависит от состояния здоровья ГЭС ячеек, которые используются. Клетки проходят экспоненциальный рост и с числом низкий проход должен быть использован. Этот assay включает в себя многие переводы и дополнения решений, поэтому использование осторожно о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить ученых программы бакалавриата почтовое отделение и Новартис институтов для биомедицинских исследований в целом для финансирования этого исследования.
Materials
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease–systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging–need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
- Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
- Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
- Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
- Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
- Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
- Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
- Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
- Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
- Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
- Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
- Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
- Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
- Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
- Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
- Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
- Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
- Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
- Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
- Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
- Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
- Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).
