Summary

カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現

Published: October 02, 2018
doi:

Summary

このプロトコルは、抽出と成木L の細胞懸濁液中のカフェインの定量のための効率的な方法論と表現レベルのカフェイン合成酵素の酵素活性を評価するための実験的プロセスについて説明します。この酵素を符号化する遺伝子。

Abstract

カフェイン (1,3,7-トリメチルキサンチン) はコーヒーやお茶など人気のある飲み物でプリン アルカロイドです。この二次代謝産物は、抗菌作用があり、自然な殺虫剤であるので化学防衛とみなされます。カフェインは、周囲の植物の成長を防ぐ負のアレロパシー効果を生成できます。さらに、世界中の人々 はその鎮痛剤と促進の効果のためのカフェインを消費します。ためにカフェインの技術のアプリケーションの関心は、この化合物の生合成経路の研究は成長しています。これらの研究は、カフェインの生合成を調節する生化学的および分子メカニズムの理解に主に焦点を当てています。体外培養は、この生合成経路を研究するための便利なシステムになっています。この記事は、その活動と同様、l. c. のアラビカ種の細胞懸濁液にカフェインの定量化のためのカフェイン合成酵素 (CS) をエンコード (CCS1) 遺伝子の転写レベルを測定手順プロトコルを説明します。

Introduction

カフェインは、コーヒーノキ1属の植物によって生合成される二次代謝産物です。このアルカロイドはメチルキサンチンのファミリーに属するし、は病原体と植食者の2,3の悪影響に対して振舞うことだから化学プラント防衛とみなされます。さらに、この代謝物は、コーヒーを飲む、一般的に消費されて世界4,5である刺激的な特性を担います。その特性のためいくつかの研究グループは、生合成経路とカフェイン67の異化作用の勉強に興味があります。現在、植物培養細胞・組織培養は、様々 な生物的・非生物的戦略8,9カフェイン蓄積の評価のための代替として機能します。

カフェイン合成には順序N続く対応するリボース ヌクレオシドから 7 メチルキサンチンの加水分解のリリースが含まれます-3 と 1 の位置でメチル化。特定Ss-アデノシルメチオニン (SAM)-依存 N-メチルトランスフェラーゼ (NMT) に対し位置 7、メチル化を触媒するテオブロミン合成酵素 (TS) CS が関与しているの 3-、1-メチル化、それぞれ、テオブロミンを生産し、カフェイン。明確な NMTs をコードする遺伝子の研究は、カフェイン生産10,11を調節するメカニズムを理解することを許可しています。N-メチルトランスフェラーゼ活性である CS カフェイン11の生合成経路の最後の 2 つのステップを触媒します。コーヒーの木の苗の光放射がカフェイン生合成の増加で起因する CS 活動を増やすことができますが示されています。最近では、光照射下で、成木L. 細胞懸濁液の保守がカフェイン8の生合成経路に影響を与える非生物的ストレス要因を作り出す効果を評価するための最適な条件であることを示した。これらの研究で得られた情報は、このような培養システムでカフェインの生合成経路の研究を最大化するため代謝工学とシステム生物学のアプリケーションにあります。

アラビカの c. l. の細胞懸濁液にカフェインの抽出条件を最適化カフェイン生合成の研究のための適切なモデルを得ることの利点を考えると、また、コーヒーノキカフェイン合成酵素 1 (CCS1) この酵素の遺伝子転写のレベルを評価するための方法論的手順と同様に、酵素活性を研究するための有用なプロトコルを開発することが可能だった。症例を抽出し、薄層クロマトグラフィー (TLC デンシトメトリー) デンシトメトリーによって成木細胞懸濁液にカフェインを定量化するためのプロトコル。

Protocol

1. カフェインアラビカの c. l. の細胞懸濁液の抽出 C. アラビカ細胞懸濁液9を使用します。連続光 (8.3 W/m2) の下で 25 の ° C で揺れ定数 100 rpm と ph 4.3 培地、培培地で隔週のサブカルチャが懸濁液を維持します。 11 μ m 孔フィルター紙とブフナーを使って吸引ろ過の下のセルを収穫します。 スケールを使用してください集められたセ?…

Representative Results

カフェイン抽出物紹介プロセスを介して取得は、図 1に示すスキームに従ってプレートクロマトグラフィにサンプルをかけることによって TLC デンシトメトリーによって分析されました。この化合物は商業標準の様々 な濃度の細胞抽出液のカフェイン、カーブのレベルを定量化するには、(図 2 a) を使用します。カフェイン?…

Discussion

カフェイン コンテンツを評価するための最適の条件をここで提案する、CS 活動とトラン スクリプト レベルの体外植物ティッシュ文化、成木の細胞懸濁液など。以前のレポートは、カフェイン成分分離手法を評価することが可能となって、カフェインのレベルを高めるための適切なパラメーターを維持する細胞と培養液中のテオブロミンの存在下で光照射下におけるには確認し?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

当研究室の仕事は、SMTHS に国立ナシオナル デ サイエンス y テクノロジー (CONACyT 219893) からの助成金によって賄われていた。この研究も、CONACyT、システマー ナシオナル ・ デ ・ Investigadores (4422) で RJPK (号 37938) に与えられる奨学金によって支えられました。著者は、この原稿の執筆の間に、そのインストールの使用のため CIATEJ をありがちましょう。特別な感謝は、この記事の撮影中に施設の分子生物学セクションとバレンティン メンドーサ ・ ロドリゲス、IFC、UNAM のすべての推薦の博士ビクター マヌエル ・ ゴンサレス ・ メンドーサまで延長されます。

Materials

Murashige & Skoog Basal salt mixture PhytoTechnology Laboratories M524 Packge Size: 50 L
Reagent (mg/L)
Ammonium Nitrate (1650)
Boric acid (6.2)
Calcium chloride, anhydrous (322.2)
Cobalt Chloride•H2O (0.025)
Cupric Sulfate•5H2O (0.025)
Na2EDTA•2H2O (37.26)
Ferrous Sulfate•7H2O (27.8)
Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7)
Manganese Sulfate•H2O (16.9)
Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25)
Potassium Iodide (0.83)
Potassium Nitrate (1900)
Potassium Phosphate, Monobasic (170)
Zinc Sulfate•7H2O (8.6)
Supplemented with
myo-inositol (100)
thiamine (10)
cysteine (25)
sucrose (30000)
2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3)
6-benzylamine purine (1)
Caffeine SIGMA C0750-5G STANDARD-5g
Theobromine SIGMA T4500 20 g
CAMAG TLC Scanner-4 CAMAG 27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software CAMAG 1.4.10 Software
Isoamyl alcohol (24:1) SIGMA C-0549 500 mL
Cyclohexane JALMEX C4375-13 1 L
Acetone J.T. BAKER 900643 4 L
Methanol J.T. BAKER 9093-03 4 L
Chloroform JALMEX C-4425-15 3.5 L
TLC silica gel 60 F254 Merck 1.05554.0001 TLC plate
β-mercaptoethanol M6250 SIGMA 100 mL
(+)-sodium L- ascorbate A4034 SIGMA 100 g
Trizma base SIGMA T6066 1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38% J.T. Baker 9535-05 2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo scientific 232227 Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine Perkin Elmer NET155 Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials SIGMA Z253081
Thermostatic bath/circulator Cole Parmer 60714
Micro centrifugue tube Eppendorf Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials Heathrow Scientific HS23202A 2 mL
Centrifuge 5804 Eppendorf 5804 000925
Vortex Thermolyne LR 5947
Porcelain mortar Fisherbrand FB961B
Filter paper Whatman Z274844 Porosity medium
Picofuge Stratagene 400550 2000 x g
Analytical balance AND HR-120 Model HR-120
Scintillation counter Beckman Coulter 6500
Gel photodocumentation system Bio-Rad Chemic XRS Model Chemic XRS
Compact UV lamp UVP 95002112 UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel SIGMA 2419907 Type 37600 mixer
TRIzol reagent Thermo scientific 15596-018 200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase Thermo scientific #EP0441 10000 U
Oligo (dT)18 primer Thermo scientific #S0131 100 µM
DNase I, RNase-free Thermo scientific #EN0525 1000 U
Magnesium chloride Thermo scientific EN0525 1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid Thermo scientific EN0525 1 mL
dNTP mix Thermo scientific R0191 R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X) Thermo scientific K0251 For 200 reactions of 25 µL
PikoReal Thermo scientific 2.2 Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure USB J75829 100 mL
Isopropyl alcohol Karal 2040 1 L
Ethyl alcohol SIGMA 64175 1 L
Diethyl pyrocarbonate SIGMA D5758 100 mL
Lab Rotator LW Scientific Mod. LW210

References

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Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Hernández-Sotomayor, S. T. Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions. J. Vis. Exp. (140), e58166, doi:10.3791/58166 (2018).

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