Reglamento de medio ambiente de la cromatina es un proceso esencial para expresión génica adecuada. Aquí, describimos un método para controlar la expresión génica a través de la contratación de modificadores de la cromatina maquinaria de manera gene-específica y reversible.
Regulación de la compactación de la cromatina es un proceso importante que regula la expresión génica en eucariotas superiores. Aunque la compactación de la cromatina y regulación de la expresión génica se interrumpen comúnmente en muchas enfermedades, ha faltado un método para estudiar y controlar estos mecanismos de acción específicas de locus endógeno y reversible. Para solucionar este problema, hemos desarrollado y caracterizado novela moléculas bifuncionales Regulación génica. Uno de los componentes de la molécula bifuncional se une a un anclaje de proteínas de ADN que se reclutarán a un locus específico de alelo. El otro componente activa endógena celular maquinaria de modificadores de la cromatina, reclutamiento de estas proteínas a un gen de interés. Estas pequeñas moléculas, llamadas modificadores químicos epigenéticos (CEMs), son capaces de controlar la expresión de genes y el ambiente de la cromatina en forma dosis dependiente y reversible. Aquí detallamos un enfoque CEM y su aplicación para disminuir la expresión génica y la acetilación de histonas cola a un reportero de la proteína fluorescente verde (GFP) situado en el locus Oct4 en células madre embrionarias de ratón (troncales). Caracterizamos el plomo CEM (CEM23) mediante microscopia fluorescente, citometría de flujo e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), seguida de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Mientras que la potencia de este sistema se demuestra en el locus Oct4 , conceptualmente, la tecnología CEM es modular y puede ser aplicada en otros tipos celulares y en otros lugares geométricos genomic.
La cromatina consiste en ADN envuelto alrededor de las proteínas de octámero de histonas que forman la partícula núcleo del nucleosoma. Regulación de la compactación de la cromatina es un mecanismo esencial para adecuada ADN reparación, replicación y expresión1,2,3. Una forma en la que las células controlan el nivel de compactación es a través de la adición o eliminación de varias modificaciones de cola post-traduccionales de la histona. Dos tales modificaciones incluyen acetilación de la lisina (1), que es más comúnmente asociada con la activación del gen, y la metilación de la lisina (2), que puede estar asociada con activación de gen o represión, dependiendo del contexto del aminoácido. La adición de las marcas de la acetilación y la metilación es catalizada por las histonas acetiltransferasas (HATs) e histona metiltransferasas (HMTs), respectivamente, mientras que la eliminación de la marca se hace por histona deacetilasas (HDAC) e histona demetilasas (HDMs ), respectivamente de4,5. Aunque la existencia de estas proteínas ha sido conocida durante décadas, muchos mecanismos de maquinaria como modificadores de la cromatina obras para regular adecuadamente la expresión de genes quedan por definirse. Procesos de regulación de la cromatina son normales en muchas enfermedades humanas, nueva visión mecanicista podría conducir a futuras aplicaciones terapéuticas.
La cromatina en vivo (CiA) es una técnica recientemente descrita que utiliza un inductor químico de proximidad (CIP) para controlar la contratación de maquinaria modificadores de la cromatina a un locus específico6. Esta tecnología se ha utilizado para el estudio de una lista creciente de la dinámica de la cromatina, como modificación de las histonas proteínas, remodeladores de cromatina y transcripción factores6,7,8,9. Cromatina basada en CIP inmovilización de proteínas expresadas exógenamente ha también se ha extendido más allá de la CiA para modular lugares geométricos genéticos no modificado por uso con una proteína desactiva agrupadas regularmente otro corto palindrómico repite CRISPR (dCas9) 10 , 11. en el sistema CiA, troncales han sido modificados para expresar un gen reportero GFP en el locus Oct4 , una zona altamente expresa y estrictamente regulado del genoma mESC. Anteriormente, este sistema se ha aplicado para describir la contratación dependiente de la dosis y reversible de la proteína exógena expresada de la heterocromatina 1 (HP1), una enzima que se une de H3K9me3 y propaga represivas marcas (por ejemplo, H3K9me3) y ADN la metilación6. Para lograr este tipo de estrategia de reclutamiento, las troncales se infectan con un plásmido que expresa una proteína de unión a FK506 (FKBP) ligada a un Gal4, que es un ancla de ADN-proteína que se une a una matriz de Unión Gal4 aguas arriba de la reportera GFP. Las células también están infectadas con un dominio de FKBP-rapamicina-obligatorio (FRB) conectado a HP1. Cuando las troncales son expuestos a concentraciones nanomolar baja del CIP, rapamicina, FRB y FKBP, se reunió en el lugar de destino. Dentro de días de tratamiento de rapamicina, se reprime la expresión del gen objetivo, evidenciada por citometría de flujo y microscopía de fluorescencia, y la acetilación de las histonas está disminuida, de viruta y secuenciación de bisulfito. Mientras que el desarrollo y validación de este enfoque han sido significativos avances en el campo de la investigación de la cromatina y la regulación, una desventaja es la necesaria expresión exógena de modificadores de la cromatina maquinaria.
Para que la tecnología basada en el reclutamiento de sólo endógenas enzimas fisiológicamente relevantes y hacer un sistema más modular, había diseñado y caracterizado nuevos moléculas bifuncionales, denominadas CEMs (figura 1)12. Uno de los componentes de las CEMs incluye FK506 que, similar a la rapamicina, se une firmemente y específicamente a FKBP. Así, los CEMs todavía serán reclutados para el locus Oct4 en las troncales de la CiA. El otro componente de las CEMs es una molécula que se une maquinaria endógena modificadores de la cromatina. En un estudio piloto, hemos probado CEMs que contienen inhibidores de las HDACS. Mientras que el concepto de usar un inhibidor para recluta HDAC parece contra-intuitivo, el inhibidor es capaz de reclutar actividad HDAC al gen de interés. Esto se logra mediante (1) reorientar la HDAC al lugar geométrico, liberando la enzima, aumentando la densidad de las HDACs no inhibidas en el área y la inhibición de la HDAC (2) mantener en el lugar geométrico, y reclutamiento de complejos represivos que se unen a las HDACs inhibidas, o (3) una combinación de ambos. En un estudio anterior, demostramos que la CEMs fueron capaces de reprimir con éxito el reportero GFP de forma dosis y tiempo dependiente, así como de una manera que fue rápidamente reversible (es decir, dentro de las 24 horas)12. Nos caracteriza la capacidad de la tecnología CEM presentada aquí a la expresión de genes de control usando microscopía de fluorescencia, citometría de flujo y la capacidad para controlar el ambiente de cromatina mediante qPCR ChIP6. Aquí, describimos un método para el uso y caracterización de los CEMs, que facilitarán la adaptación de este sistema para responder a preguntas adicionales relacionadas con la biología de la cromatina.
Aquí, describimos el sistema recientemente desarrollado de CEM se aplica para regular la expresión de genes y medio ambiente de la cromatina en un gen específico en una manera dose-dependent. Ofrecemos un método preciso para estudiar la dinámica implicada en la regulación de expresión génica a través de la contratación selectiva de proteínas reguladoras específicas cromatina endógena. Esta es una tecnología altamente modular que puede ser aplicada para investigar cómo diferentes proteínas y cromatina-modi…
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a los miembros de los laboratorios de Hathaway y Jin para sus discusiones útiles. Los autores agradecen también Dan Crona y Ian MacDonald para su lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por Grant R01GM118653 de los institutos nacionales de salud de Estados Unidos (a N.A.H.); y por donaciones R01GM122749, R01CA218600 y R01HD088626 de la Nacional de los Estados Unidos institutos de salud (J.J.). Este trabajo fue apoyado también por un nivel 3 y un estudiante becado por la UNC Eshelman Instituto de innovación (N.A.H y A.M.C, respectivamente). Financiación adicional de un GM007092 de T-32 (a A.M.C) apoyó este trabajo. Datos de citometría de flujo se obtuvieron en la UNC flujo Cytometry instalaciones centrales financiado por una P30 CA016086 cáncer centro base apoyo beca a UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.
DMEM | Corning | 10-013CV | |
NEAA | Gibco | 11140-050 | |
HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
Sonicator | Covaris | E110 | |
Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
PBS | Corning | 46-013-CM | |
BSA | Fisher | BP9700 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
EDTA | Fisher | S311-100 | |
NaCl | Fisher | S271-1 | |
Glycerol | Fisher | G33-1 | |
Tris | Fisher | BP152 | |
NP40 | Roche | 11754599001 | |
Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
Glycine | Fisher | BP381-500 | |
TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |