Проведение нескольких режимов изображения с одной флуоресцентным микроскопом
Summary
Здесь мы представляем практическое руководство построения интегрированных микроскопии системы, которая объединяет обычные epi флуоресцентных изображений, сингл молекула на основе обнаружения суперразрешением изображений и многоцветные сингл молекула обнаружения, включая Одноместный молекула флуоресценции передачи энергии резонанса изображений в один настройки в экономически эффективным способом.
Abstract
Микроскопии флуоресцирования является мощным инструментом для выявления биологических молекул на месте и мониторинга их динамики и взаимодействия в режиме реального времени. Помимо обычных epi флуоресцентной микроскопии для достижения конкретных экспериментальных целей были разработаны различные методы обработки изображений. Некоторые из широко используемых методов включают сингл молекула флуоресценции передачи энергии резонанса (smFRET), который может сообщить конформационные изменения и молекулярных взаимодействий с Ангстрем резолюцией и одной молекулы на основе обнаружения супер-резолюции (SR) изображений, которые могут повысить пространственным разрешением около десяти в twentyfold по сравнению с дифракционный микроскопии. Здесь мы представляем клиентов разработана комплексной системы, которая объединяет несколько методов обработки изображений в одном Микроскоп, включая обычных epi флуоресцентных изображений, изображений на основе обнаружения SR одной молекулы и многоцветные сингл молекула обнаружения, включая smFRET изображений. Различные методы обработки изображений можно легко и можно воспроизвести путем переключения оптических элементов. Эта установка легко принять любой научно-исследовательской лаборатории в биологических наук с необходимостью для рутинных и различных изображений экспериментов на снижение стоимости и пространстве относительно создания отдельных микроскопы для индивидуальных целей.
Introduction
Флуоресценции Микроскопы являются важными инструментами исследований современной биологической науки и флуоресцентных изображений регулярно проводится во многих лабораториях биологии. Путем пометки биомолекул интерес с флуорофоров, мы можем непосредственно визуализировать их под микроскопом и записывать время зависимых изменения в локализации, конформации, взаимодействия и Ассамблея государств в естественных условиях или в пробирке. Обычных флуоресценции Микроскопы имеют дифракционный пространственным разрешением, который является ~ 200-300 Нм в боковую сторону и ~ 500-700 Нм в осевом направлении1,2и, таким образом, ограничивается изображений на 100s Шкала нанометров до микрона. Для того, чтобы выявить тонкие детали в молекулярной сборки или организации, были разработаны различные SR microscopies, которые могут нарушить дифракционного предела. Стратегии, используемые для достижения SR включают нелинейных оптических эффектов, таких как простимулированное излучение истощения (интереса) микроскопия3,4 и структурированного освещения микроскопии (SIM)5,6, 7, стохастический обнаружения одного молекул, например стохастических оптических реконструкции микроскопии (шторм)8 и photoactivated локализации микроскопии (PALM)9и сочетание обоих, например, MINFLUX10. Среди этих SR microscopies сингл молекула на основе обнаружения SR Микроскопы могут быть относительно легко изменены из одной молекулы Микроскоп set-up. С повторяющихся активации и изображений photoactivatable флуоресцентных белков (FPs) или фото переключаемый красители, отмеченных на биомолекул интерес пространственное разрешение может достигать 10-20 Нм11. Чтобы получить информацию о молекулярных взаимодействий и конформационные динамика в режиме реального времени, Ангстрем нанометровая резолюции не требуется. smFRET12,13 является одним из подходов к достижению этой резолюции. Как правило в зависимости от биологических вопросов интерес, необходимы методы обработки изображений с различным пространственным разрешением.
Как правило для каждого типа изображения, необходима возбуждения и/или выбросов оптических конфигурации. Например один из наиболее часто используемых освещения методов для обнаружения одной молекулы — посредством полного внутреннего отражения (МДП), в котором конкретные возбуждения угол необходимо достичь через призму или объектива. Для обнаружения smFRET выбросы от доноров и акцепторов красители нужно быть пространственно разделены и направлены в различные части электрон умножения, зарядовой (EMCCD), которое может быть достигнуто с набором зеркал и дихроичный пучка сплиттер помещены в пути выбросов. Для трехмерной (3-D) SR изображений, оптические компоненты, такие как Цилиндрические линзы14, необходимо вызвать эффект астигматизма по пути выбросов. Таким образом homebuilt или коммерчески доступных интегрированных Микроскопы обычно, функционально специализированные для каждого типа изображений метод и не являются гибкими, чтобы переключаться между различными методами визуализации на же настройки. Здесь мы представляем экономически, гибридная система, которая обеспечивает регулируемый и воспроизводимые переключает трех различных методов обработки изображений: обычные epi люминесцентные изображений с разрешением дифракционный, сингл молекула на основе обнаружения SR изображений и многоцветные сингл молекула обнаружения, включая smFRET изображений (рис. 1A). Конкретно здесь представлены настройки содержит волокна в сочетании входных лазеры для возбуждения многоцветные и коммерческого освещения руку в пути возбуждения, который позволяет запрограммированы контроля возбуждения угла, чтобы переключаться между epi режиме и в режиме МДП. В пути выбросов съемный homebuilt Цилиндрические линзы кассету помещается внутри тела микроскоп для 3-D визуализации SR, и коммерческие пучка сплиттер помещается перед EMCCD камеры, которые могут быть выборочно включены обнаружить множественные каналы выбросов одновременно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот Микроскоп гибридной системы исключает необходимость покупки нескольких микроскопы. Общая стоимость всех частей, включая таблицы оптики, таблице трудовых установки, программное обеспечение и рабочей станции, это около $230000. Обработанные пользовательских частей, включая mag объект?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.F. выражает поддержку от программы ученых Сирл и директор NIH новый новатор премии. Авторы признают полезные предложения от Paul Selvin лаборатории (Иллинойский университет, г. Урбана-Шампейн) для позиционирования 3-D объектива.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. . Optical physics. , (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
