Summary

Yönbağımlı polimer yapay antijen hücreleri CD8 + T Hücre aktivasyonu için sunma imalatı

Published: October 12, 2018
doi:

Summary

Burada, hızlı ve tekrarlanarak ayarlanabilir boyutu, şekli ve yüzey proteini tanıtımı için T hücre genişletme ex vivo veya içinde vivo hücre (aAPC) sunan biyolojik ilham, biyolojik olarak parçalanabilen articifical antijen üretmek için bir iletişim kuralı mevcut .

Abstract

Yapay antijen sunan hücreler (aAPC) T hücreleri uyarmak için güçlü yeteneklerini nedeniyle bağışıklık modülasyonu için umut verici bir platform vardır. Acellular yüzeylerde sinyal sunu parametrelerinin kesin kontrol ve T hücreleri ile olan etkileşimleri modüle için aAPC yüzeyinin fiziksel özellikleri de dahil olmak üzere aAPC, hücre tabanlı anahtar avantajlar sunuyor. Yönbağımlı parçacıkları, inşa aAPC özellikle ellipsoidal parçacıklar, küresel karşılıkları, uyarıcı T hücreleri artan bağlama ve daha büyük yüzey alanı T hücre için kullanılabilir nedeniyle de ilgili kişi, daha etkili olduğu gösterilmiştir olarak nonspesifik alımı ve gelişmiş farmakokinetik özellikleri azaltılmış. Yönbağımlı parçacıklar artan ilgi rağmen bile yaygın ince film germe uygulamak ve tekrarlanarak zor olabilir gibi anizotropik parçacıklar yöntemleri kabul.

Bu amaçla, biyolojik olarak parçalanabilen anizotropik parçacık tabanlı aAPC tunable boyut, şekil, ile hızlı, standart imalatı için bir iletişim kuralı tanımlamak ve sunum T hücre genişletme ex vivo ve in vivo, yöntemleri için birlikte için sinyal onların boyutu, Morfoloji ve yüzey protein içeriği, karakterize ve işlevselliğini değerlendirmek için. Yönbağımlı aAPC imalatı bu ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir, aAPC için “kapalı” immunotherapies üretmek için ideal hale yaklaşımdır.

Introduction

Onlar sağlam antijen spesifik T hücre yanıt oluşturabilir çünkü yapay antijen sunan hücreler (aAPC) immunomodulatory ajanları olarak söz göstermiştir. Bu platformlar için temel yeteneklerini çok önemli sinyaller T Hücre aktivasyonu için verimli bir şekilde sunmak için vardır. Acellular aAPC çünkü onlar daha kolay ve daha az maliyetli imal, ölçek-up ve çeviri sırasında daha az sorunlarla karşı karşıya ve hücre tabanlı terapiler ile ilgili riskleri hafifletmek hücre tabanlı aAPC için cazip bir alternatif vardır. Acellular aAPC de yüksek derecede sinyal sunu parametreleri üzerinde kontrol ve T hücreleri1ile arayüzü yüzey fiziksel özellikleri için izin verir.

aAPC iki sinyal T Hücre aktivasyonu için gerekli en az özetlemek gerekir. Sinyal 1 antijen tanıma sağlar ve T hücre reseptör (TCR) tanır ve ben ya da karmaşık TCR sinyal sonuçlanan soydaş, antijen taşıyan II MHC sınıf ile yürütmektedir oluşur. Antijen özgüllük gereksinimi atlamak için aAPC sistemleri genellikle karşı nonspecifically TCR karmaşık uyarır CD3 reseptör agonistik bir monoklonal antikor ayı. MHC, özellikle MHC multimers, rekombinant formları da aAPC yüzeyinde antijen özgüllük2,3sağlamak için kullanılmıştır. Sinyal 2 T hücre etkinliği yönlendirir costimulatory bir sinyalidir. 4-1BB gibi diğer costimulatory reseptörleri başarıyla hedeflenen4olmasına rağmen costimulation T Hücre aktivasyonu için gerekli sağlamak için CD28 reseptör genellikle aAPC yüzeyi üzerinde sunulan agonistik bir antikor ile uyarılır. 1 ve 2 sinyal proteinleri genellikle aAPC sentezlemek için katı parçacıklar yüzeyinde immobilize. Tarihsel olarak, aAPC polistren4,5 ve demir dextran6gibi malzemelerin çeşitli fabrikasyon. Daha yeni sistemleri yararlanmak poli (laktik-co-Glikolik asit) gibi biyobozunur polimerler (PLGA) kolayca proteinler sinyal birleştiğinde, doğrudan yönetim içinde vivoiçin uygundur ve sürekli serbest bırakılması kolaylaştırabilir aAPC oluşturmak için sitokinler veya T hücre harekete geçirmek7,8ek olarak çözünür faktörler kapsüllenir.

Gerekli sinyal proteinleri varlığı ek olarak, yeterince büyük yüzey alanı üzerinden reseptör nişan aAPC/T hücre etkileşim sırasında T Hücre aktivasyonu için gereklidir. Böylece, aAPC boyutu ve şekli gibi fiziksel parametrelerini büyük ölçüde onların mevcut temas bölgesinin değiştirmek ve T hücreleri uyarmak için yeteneklerini etkiler. Mikron büyüklüğünde aAPC gösterilmiştir uyarıcı T hücreleri onların nano karşıtları9,10dan daha etkili olduğu. Ancak, nano-aAPC üstün biodistribution ve onların performans vivo içinde mikro-aAPC11üzerinde artırabilir lenf düğümleri için daha iyi drenaj olabilir. Şekil aAPC parçacık tabanlı sistemler ilgi başka bir değişkendir. Yönbağımlı aAPC son zamanlarda gösterilmiştir uyarıcı T hücreleri, özellikle hedef hücreleri azaltılmış belirsiz hücre alımı ile birleştiğinde ile gelişmiş etkileşim nedeniyle izotropik parçacıklar daha etkili olmak. Hücreler tercihen ellipsoidal parçacıklar uzun eksene bağlamak ve eğrilik ve düz yüzey daha büyük yarıçapı izin aAPC ve T hücre12arasında daha fazla temas için. Ellipsoidal parçacıklar uzun ekseninin aynı zamanda küresel parçacıklar vivo içinde Yönetim12,13takip göre artan dolaşım zaman sonuçlanan fagositoz, teşvik etmemektedir. Bu avantajlar nedeniyle ellipsoidal parçacıkların mikro ve nanoscales12efekti gözlenen antijen spesifik T hücreleri vitro ve in vivo küresel parçacıklar için karşılaştırıldığında daha fazla genişlemesi aracılık, 13. Yönbağımlı partikülleri imal etmek çeşitli strateji vardır, ama ince film germe farklı parçacık şekil14bir dizi oluşturmak için kullanılan basit, yaygın olarak kabul gören bir yöntem olduğunu. Sentez, parçacıklar filmlerine döküm ve bir veya iki boyutlu bir sıcaklık parçacık malzeme cam geçiş sıcaklığı yukarıda gergin. Filmin ardından parçacıkları almak için tasfiye edilir. Yönbağımlı parçacıklar ilgi büyüyen rağmen imalatı parçacık tabanlı aAPC için geçerli yaklaşımlar çoğunlukla izotropik sistemleri ile sınırlı ve parçacık şekil değiştirme yöntemleri uygulamak zor, bazı aAPC sentezi ile uyumsuz olabilir stratejileri ve -sizlik çekmek-hassasiyet ve tekrarlanabilirlik15. Bizim ince film germe tekniği el ile gerçekleştirilen veya bir ya da iki boyutları15dakika sonra istenen bir en boy oranı hızla anizotropik parçacıklar biyobozunur polimerler çeşitli sentez oluşturmak için bir otomatik biçimde, gergin.

Bizim önceki çalışmaları temel, geliştirdiğimiz içinde hızla T hücre genişletme ex vivo veya için standart bir biçimde aAPC ayarlanabilir boyutu ve şekli oluşturmak için ölçeklenebilir ince film germe teknoloji ile birlikte biyolojik bir parçacık dayalı yaklaşım Vivo. Protein konjugasyon stratejimiz bu aAPC sistemi yüksek oranda esneklik veren karboksil grupları için istenen bir yoğunluk, parçacık yüzeyinde herhangi bir protein(s) ilgi çift için kullanılabilir. Ayrıca boyutu, Morfoloji ve yüzey protein aAPC içerik karakterize ve onların işlevselliği vitrodeğerlendirmek için yöntemleri açıklar. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücreleri ex vivo veya vivo içinde çeşitli immunotherapeutic uygulamalar için genişletmek için kolayca adapte edilebilir.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. küresel PLGA parçacıklar Tunable boyutta imalatı Parçacık sentezi için malzeme hazırlanması % 5 w/w Polivinil alkol (PVA) çözüm hazırlamak. Bir Erlenmeyer şişesi bir manyetik heyecan çizgiyle 500 mL deiyonize (DI) su ekleyin ve elektrikli karıştırıcı 500 rpm ve monitör sıcaklık termometre ile yerleşt…

Representative Results

Bir şematik cihaz germe otomatik 2D ince film için Şekil 1′ de verilmiştir. Bir şematik ve aygıt uzanan ince bir 1 D film için açıklama sedye Alüminyum parçalar standart frezeleme ve işleme teknikleri kullanarak inşa edilmiştir Ho ve ark.17 verilir. Benzer şekilde 1D sedye, 2D sedye metalik kulpları ve kılavuz raylar oluşur. Çift yönlü Kurşun vidalar için dönme hareketi doğrusal çevirmek için kullanılır. Ku…

Discussion

Bu iletişim kuralı anizotropik polimer parçacıkları kesin üretimi için çok yönlü bir yöntemi ayrıntıları. Ölçeklenebilir, tekrarlanabilir ve ucuz burada açıklanan tekniği uzanan ince filmidir. Yönbağımlı parçacıklar üretmek için alternatif teknikleri yüksek maliyetli, düşük performans ve sınırlı partikül boyutu da dahil olmak üzere birçok sınırlamalar acı. Yaklaşım uzanan ince film parçacıklar sonra sentez anizotropik olmak değiştirilir de avantajlı çünkü ve sonuç olarak…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

EBA (DGE-1746891) ve KRR (DGE-1232825) NSF yüksek lisans araştırma bursu program destek için teşekkür ederim. RAM teşekkür Ulusal Araştırma hizmet ödülü NIH ncı F31 (F31CA214147) ve üniversite bilim adamları burs desteği için başarı ödülleri. Yazarlar teşekkür NIH (R01EB016721 ve R01CA195503), körlüğü James önlemek ve Carole ücretsiz Catalyst Ödülü, araştırma ve destek için kanserli hastalarda JHU Bloomberg-Kimmel Enstitüsü.

Materials

Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed Polysciences, Inc. 02975-500
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Digital Thermometer Fluke N/A Model name: Fluke 52 II
Immersion Temperature Probe Fluke N/A Model name: Fluke 80PK 22
Digital Hotplate & Stirrer Benchmark Scientific H3760-HS
Multipoint stirrer Thermo Fisher Scientific 50093538
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich 719900
Dichloromethane Sigma-Aldrich D65100
Homogenizer IKA  0003725001
Sonicator Sonics & Materials, Inc. N/A Model number: VC 505
Sonicator sound abating enclosure Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0427
Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0220
Sonicator microtip Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0423
High speed centrifuge Beckman Coulter N/A Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP
High speed centrifuge rotor Beckman Coulter 369691 Model number: JA-17
High speed polycarbonate centrifuge tubes Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 mL, screw cap
Rectangular disposable petri dish VWR International 25384-322 75 x 50 x 10 mm
Square disposable petri dish VWR International 10799-140 100 mm x 100 mm
LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody Biolegend 100314
InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 Bio X Cell BE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E6383
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt Sigma-Aldrich 56485
MES Sigma-Aldrich M3671
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100212
APC anti-mouse CD28 Antibody Biolegend 102109
Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate Sigma-Aldrich CLS3915 flat bottom, black polystyrene
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11875093
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135 Heat Inactivated, sterile-filtered
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Recombinant Human IL-2 (carrier-free) Biolegend 589102
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360070
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
MEM Vitamin Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11120052
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyi Biotech 130-104-075
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFisher Scientific C34554
LS Columns Miltenyi Biotech 130-042-401
MidiMACS Separator Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS Multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
Flow Cytometer Accuri C6
Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader BioTek
autoMACS Running Buffer Miltenyi BIotech 130-091-221
Cell Strainer ThermoFisher Scientific 22363548 Sterile, 70 µm nylon mesh
ACK Lysing Buffer ThermoFisher Scientific A1049201
C57BL/6J (Black 6) Mouse The Jackson Laboratory 000664 Male, at least 7 weeks old
U-Bottom Tissue Culture Plates VWR 353227 Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates
40 V DC Power Supply Probotix LPSK-4010
PTFE Coated Wire Mouser 602-5858-100-01 This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work
Stepper Motor Driver Probotix MondoStep5.6
IDC Connector Kit Probotix IDCM-10-12
Microcontroller Probotix PBX-RF
4A Fuses Radio Shack 2701026 Equivalent fuses will work as well
DB25 Male to Male Cable Probotix DB25-6
USB-A to USB-B Cable Staples 2094915 Equivalent cable will work as well
8-Pin Amphenol Connectors Male and Female Mouser 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S
Stepper Motor Probotix HT23-420-8
Right Hand Lead Screw Roton 60722
Left Hand Lead Screw Roton 60723
Screws McMaster Carr 92196A151
Neoprene Rubber McMaster Carr 8698K51
Right Handed Flanged Lead Nut Roton 91962
Left Handed Flanged Lead Nut Roton 91963
Linux Control Computer Probotix LCNC-PC Any computer with matching specification and Linux operating system will work
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS431097
Trypan Blue Solution, 0.4 % ThermoFisher Scientific 15250061

References

  1. Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
  2. Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
  3. Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
  4. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
  5. Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
  6. Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
  7. Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
  8. Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
  9. Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
  10. Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
  11. Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
  12. Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
  13. Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
  14. Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
  15. Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
  16. Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
  17. Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
  18. Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
  19. Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
  20. Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
  21. Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
  22. Petzetakis, N., Dove, A. P., O’Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
  23. Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
  24. Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).

Play Video

Cite This Article
Ben-Akiva, E., Rhodes, K. R., Meyer, R. A., Green, J. J. Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation. J. Vis. Exp. (140), e58332, doi:10.3791/58332 (2018).

View Video