Induktion der endothelialen Differenzierung in kardialen Vorläuferzellen unter niedrigen Serum-Bedingungen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik der endothelialen Differenzierung für kardiale Vorläuferzellen. Es konzentriert sich besonders auf wie Serum-Konzentration und Dichte Zelle Aussaat der endothelialen Differenzierung Potenzial auswirken.
Abstract
Kardialen Vorläuferzellen (CPCs) möglicherweise therapeutisches Potenzial zur kardialen Regeneration nach Verletzungen. Mitten in Erwachsenen Säugetier intrinsische CPCs sind extrem selten, aber erweiterte CPCs nützlich sein könnte für Zelltherapie. Voraussetzung für die Nutzung ist ihre Fähigkeit, in einer kontrollierten Weise in die verschiedenen kardialen Linien mit definierten und effiziente Protokolle zu differenzieren. Darüber hinaus auf in-vitro- Erweiterung CPCs von Patienten isoliert oder präklinischen Krankheitsmodelle können fruchtbare Recherche-Tools für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen anbieten.
Aktuelle Studien mit, dass verschiedene Marker CPCs bestimmt werden kann. Jedoch sind nicht alle von ihnen beim Menschen geäußert, beschränkt die translationale Auswirkungen einiger präklinischen Studien. Differenzierung-Protokolle, die unabhängig von der Isolation Technik und Marker Ausdruck gelten ermöglicht den standardisierten Ausbau und Grundieren der CPC-Gebote für Zelle Therapie Zweck. Hier beschreiben wir, dass die Grundierung des CPCs unter einer niedrigen fetalen bovine (FBS) Serumkonzentration und niedrigen Zelle Dichte Bedingungen erleichtert die endotheliale Differenzierung des CPCs. mit zwei verschiedenen Subpopulationen von Maus und Ratte CPCs, wir zeigen, dass Laminin a mehr geeignetes Substrat als Fibronektin zu diesem Zweck unter das folgende Protokoll: nach Kultivierung für 2-3 Tage in Medium einschließlich Ergänzungen, dass Multipotenz behaupten mit 3,5 % FBS, CPCs sind ausgesät und auf Laminin an < 60 % Zusammenfluss und kultiviert in Ergänzung-freies Medium mit niedrigen Konzentrationen des FBS (0,1 %) für 20-24 Stunden vor der Differenzierung in endothelialen Differenzierung Medium. Da CPCs eine heterogene Bevölkerung sind, Serumkonzentrationen und Inkubationszeiten möglicherweise je nach den Eigenschaften der jeweiligen CPC Subpopulation angepasst werden. Vor diesem Hintergrund kann auch auf andere Arten von CPCs sowie die Technik und bietet eine nützliche Methode, um das Potenzial und die Mechanismen der Differenzierung und wie sie von der Krankheit betroffen sind, bei CPCs isoliert vom jeweiligen Krankheitsmodelle zu untersuchen.
Introduction
Neuere Studien unterstützen die Existenz von resident kardialen Vorläuferzellen (CPC) in den Erwachsenen Säugetier-Herz1,2,3könnte, und CPCs eine nützliche Quelle für die Zelltherapie nach kardialen Schädigung4, 5. Darüber hinaus erweiterte CPCs können eine fruchtbare Modell vorsehen, dass Drogen-Screening und die Untersuchung der Krankheitsmechanismen bei Patienten mit seltenen Kardiomyopathien, oder vom jeweiligen Krankheit isoliert Modelle6,7.
CPCs isoliert aus dem Erwachsenen Herzen besitzen Stamm/Stammvater Zelle Eigenschaften1,2,3,8 , sind multipotent, klonogenen, und haben die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. Allerdings gibt es viele verschiedene (Teil-) Populationen des CPCs präsentiert verschiedene Oberfläche Marker Profile, einschließlich, zum Beispiel c-Kit, Sca-1 und andere, oder von unterschiedlichen Isolierungstechniken (Tabelle 1) abgerufen. Verschiedene Kultur und Differenzierung Protokolle wurden etablierte1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Diese Protokolle unterscheiden sich vor allem in Bezug auf den Wachstumsfaktor und Serum Inhalte, die nach dem Zweck der Kultivierung angepasst sind und zu unterschiedlichen Ergebnisse und Ergebnisse, einschließlich Differenzierung Effizienz führen kann.
Marker-basierte Isolationstechniken:
CPC-Gebote können isoliert werden, basierend auf einer bestimmten Oberfläche Marker Ausdruck1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Frühere Studien deuten darauf hin, dass c-Kit und Sca-1 der beste Marker resident CPCs1,11,14,19,20isoliert werden kann. Da keiner dieser Marker für CPC-Gebote wirklich spezifisch ist, sind Kombinationen von verschiedenen Markern in der Regel angewendet. Z. B. während CPCs niedrige Konzentrationen von c-Kit21auszudrücken, ist c-Kit auch andere Zelltypen, einschließlich Mastzellen22, Endothelzellen23und hämatopoetischen Stammzellen/Progenitor Zellen24zum Ausdruck. Ein weiteres Problem ist die Tatsache, dass nicht alle Markierungen auf allen Arten ausgedrückt werden. Dies ist der Fall für Sca-1, die Maus aber nicht in menschlichen25zum Ausdruck bringt. Daher kann die Protokolle verwendet, die unabhängig von der Isolierung Marker sind vorteilhaft im Hinblick auf klinische Studien und Untersuchungen mit humanen Proben sein.
Marker-unabhängige Isolierungstechniken:
Es gibt mehrere Haupttechniken der CPC-Isolation, die in erster Linie unabhängig von Surface Marker Ausdruck, aber das kann durch die aufeinander folgenden Auswahl der spezifischen Marker-positiven Unterfraktionen verfeinert werden, je nach Bedarf (siehe auch Tabelle 1). (1) die Seite Bevölkerung (SP) Technik wurde ursprünglich in einer primitiven Bevölkerung von hämatopoetischen Stammzellen, die auf der Fähigkeit basiert, Ausfluss der DNA-Farbstoff Hoechst 3334226 von ATP-bindende Kassette (ABC) Transporter27gekennzeichnet. Herzmuskelzellen SP wurden durch verschiedene Gruppen isoliert und berichtet, dass eine Vielzahl von Markern mit einigen kleinen Unterschieden zwischen Berichte2,8,13,14zum Ausdruck bringen. (2) koloniebildenden Einheit Fibroblastenzellen (KBE-Fs) ursprünglich definiert wurden basierend auf einer mesenchymaler Stromazellen Zelle (MSC)-wie Phänotyp. Isolierte MSCs sind auf Speisen induzieren Kolonie Bildung kultiviert. Koloniebildenden MSC-wie KBE-Fs kann von Erwachsenen Herzen getrennt werden und sind in der Lage, in kardialen Linien15zu unterscheiden. (3) Cardiosphere-abgeleitete Zellen (CDC) sind einzelne Zellen aus Gruppen von Zellen aus Gewebebiopsien gewachsen oder explants28,29,30,31. Es wurde kürzlich gezeigt, die meist die CD105+/CD90–/c-kit– Zelle Bruchteil Exponate, Cardiomyogenic und regenerative potenzielle32.
Hier bieten mit SP-CPCs von Mäusen isoliert, wir ein Protokoll zur effizienten Einarbeitung von endothelialen Linie basierend auf einer früheren Studie CPCs Ratte und Maus SP-CPCs33. Das Protokoll enthält spezifische Anpassungen an die Kultur und Ausbau Technik in Bezug auf die Zelldichte, der Serum-Inhalt des Mediums und dem Substrat. Es kann nicht nur auf Maus SP-CPCs angewendet werden, aber zu verschiedenen Arten von CPC-Gebote für den Zweck, einen Schicksal Wechsel von einer Verstärkung zu einer endothelialen begangen CPC zu induzieren, sei es im Hinblick auf die Transplantation dieser Zellen sowie deren Nutzung für mechanistische in-vitro- Studien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vorteile dieses Protokolls:
Dieses Protokoll bietet eine Technik der endothelialen Differenzierung des CPCs. Wir fanden, dass eine niedrige Serumkonzentration und geringer Zelldichte die Effizienz der endothelialen Differenzierung, wobei LN erwies sich als ein geeigneter Substrat als FN unter diesen Bedingungen verbessern könnte. Wir haben zwei verschiedene Arten von CPCs: Ratte CPCs, die in einer Zelle der Zeile-Manier und Maus SP-CPCs verwendet wurden, die isoliert und erweitert wurden. Vor al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Vera Lorenz für ihre hilfreiche Unterstützung während der Experimente und das Personal von der Flow Cytometry Einrichtung der Abteilung Biomedizin (DBM), Universität und Universitätsspital Basel. Diese Arbeit wurde durch den Aufenthalt auf Track-Programm an der Universität Basel (um Michika Mochizuki) unterstützt. Gabriela M. Kuster wird unterstützt durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds (Grant Nummer 310030_156953).
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
References
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