Isolamento de CD4+ T-células e análise de circulação folicular-T Helper (cTfh) célula subconjuntos de citometria de fluxo de 6 cores usando o sangue periférico

Summary

Aqui, um protocolo para o isolamento e caracterização de CD4⁺ células T subconjuntos do sangue periférico humano é descrito. Purificado CD4⁺ T-células são analisadas por citometria de fluxo para determinar proporções de subconjuntos de célula auxiliar T-folicular.

Abstract

Aberrante atividade das células foliculares-T auxiliar (Tfh) é detectável em doenças auto-imunes e sua presença está associada com desfechos clínicos, quando se analisa o microambiente linfonodal em linfoma de células B não-Hodgkin. Subconjuntos de células T-foliculares auxiliar (cTfh), o compartimento de memória circulantes de células Tfh no sangue, que circula também são perturbados na doença e, portanto, representam potenciais novos biomarcadores preditivos. Teste baseado em sangue periférico é vantajoso porque é relativamente não-invasivo e permite monitoramento serial simples. Este artigo descreve um método para isolar CD4 + T-células do sangue humano e posterior análise por citometria de fluxo para enumerar as células cTfh e as proporções de seus vários subconjuntos (cTfhPD-1^{-/ + / Oi}, cTfh1, 2, 17 e cTfh1/17). O nível destes subconjuntos foi então comparado entre indivíduos normais e pacientes com linfoma. Descobrimos que o método era robusto o suficiente para obter resultados fiáveis de material paciente rotineiramente coletada. A técnica que descrevemos para a análise pode ser facilmente adaptada para celular classificação e aplicações a jusante como RT-PCR.

Introduction

Células T-foliculares de auxiliar (Tfh) são um CD4⁺ subconjunto de células T que caracterizou-se inicialmente em tecidos linfoides¹. Estas células expressam PD-1 e receptores de superfície CXCR5, secretam IL-21 e IL-4 e mostram expressão nuclear do fator de transcrição, BCL-6^2,3. Como seu nome sugere, eles são encontrados em centros germinativos e são essenciais para anticorpos de afinidade elevada produção¹.

Dysregulated Tfh respostas têm sido implicadas na patogênese da doença, mais notavelmente a doença auto-imune, onde eles promovem a expansão de células auto-reativas B⁴. Eles também desempenham um papel no microambiente do tumor do sólido^5,6 e cancros linfoides⁷. Por outro lado, defeitos genéticos de superfície proteínas essenciais para Tfh função como resultado de costimulator (ICOS) células T inducible em síndromes de imunodeficiência humana⁸. CD4⁺ CXCR5⁺ células no sangue periférico humano são denominadas células helper T-foliculares (cTfh) de circulação e são acreditadas para ser o compartimento de memória das células Tfh em tecidos⁹. O objetivo do método descrito aqui é a análise de subconjuntos de cTfh seguindo CD4⁺ isolamento de amostras de sangue periférico de células.

Foram definidos vários subconjuntos de cTfh e a eficiência com que fornecem ajuda células B difere de um subconjunto para mais^9,10,11,12. As proporções relativas destes subconjuntos são alteradas em uma série de doenças, mais proeminentemente auto-imune em que lá é quase sempre um aumento relativo no mais funcional PD-1^{+ / Oi} e/ou subconjuntos de cTfh2 ou cTfh17 em comparação com os menos funcional PD-1^– e/ou subconjuntos de cTfh1¹². A extensão dessas mudanças frequentemente associar com parâmetros clínicos, incluindo títulos de atividade e auto-anticorpos doença, indicando um papel potencial de distribuição de subconjunto cTfh como biomarcador prognóstico na doença, que pode refletir a atividade da ESF no tecidos linfoides^9,12,13,14. Além disso, recolhendo amostras de sangue dos participantes é rápido, seguro e aceitável e então permite serial de monitoramento para a análise da progressão da doença ou resposta à terapia.

O uso de CD4 isolado⁺ de células T sobre suspensões de células mononucleares (PBMNC) de sangue periférico tradicional permite maiores experiências de citometria de fluxo da produção, reduzindo o tempo necessário para adquirir um número considerável de células de cTfh para análise. Isto é particularmente útil quando a classificação de células de cTfh rara subconjuntos usando fluxo ativado celular classificação (FACS). Para auxiliar a eficiência, estas suspensões podem ser criopreservadas para habilitar “lotes” de amostras a ser usado no experimento de citometria de fluxo. Em testes, o CD4⁺ pureza não foi reduzida em criopreservação.

Enquanto laboratórios diferentes usados diferentes marcadores para classificar cTfh células nos estágios iniciais de sua descoberta, o método apresentaram aqui faz uso de um regime unificado de dois grupos de marcadores de superfície celular como proposto por Schmidt et al.^{12, 15} para permitir a identificação simultânea de cTfh e seus subconjuntos reconhecidos nove em um único fluxo cytometry experimentar.

Como são usados apenas marcadores de superfície celular, as células não necessitam de fixação ou permeabilização e assim podem permanecer vivas para estudos funcionais a jusante. Isto poderia ser facilitado pela célula classificação usando FACS com o mesmo painel de anticorpos. Este painel pode ser expandido para incluir outros marcadores, permitindo as restrições do citômetro de fluxo sendo usado.

A análise das experiências de citometria de fluxo multi cor pode ser um desafio devido à natureza inerentemente subjetiva de gating em lotes do ponto 2-dimensional, especialmente quando populações de células não têm uma distribuição clara bi-modal na fluorescência do marcador, como é o caso para células cTfh e seus subconjuntos. Por esta razão, é imperativo para configurar os controles eficazes para reduzir os artefatos para permitir melhor resolução das populações e para definir a retenção de estratégias com confiança. Como tal, design de painel de anticorpos e a instalação de controles básicos para um fluxo cytometry experimentar, ou seja, usando a compensação e FMO controles estão descritas no passo 3.4.2 e 3.4.3,respectively.

Todas as células cTfh são definidas como CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^–. O nível de expressão do marcador característico de ativação Tfh PD-1 então pode ser determinado para identificar os subconjuntos do PD-1^–, PD-1⁺ ou PD-1^Oi cTfh células. Em seguida, usando uma combinação dos receptors do chemokine CXCR3 e CCR6, que são diferencialmente expressos pelo tradicional Th1, 2 ou 17 células, cTfh podem ser caracterizado como cTfh1, 2 ou 17-como por um perfil de CXCR3⁺ CCR6^–, CXCR3^– CCR6^– e CXCR3^– CCR6⁺, respectivamente.

O painel de anticorpos usado por nosso laboratório é exibido na tabela 1. O usuário pode ter para se adaptar a sua seleção de fluoróforo para contabilizar o laser e a configuração do filtro de luz disponível na sua citômetro de fluxo local.

As considerações a seguir influenciam a escolha de fluorophores. Sempre que possível, use fluorophores brilhante. Em particular, use o mais brilhante fluorophores disponível sobre as divisões mais marcadores (menos altamente expressas). Marcadores de redutor incluem PD-1, CXCR3 e CCR6 e em menor medida, CXCR5. Fizemos especificamente empreg o novo BB, BV e BUV fluorophores que proporcionam excelente brilho e assim permitir mais fácil resolução de populações distintas das células.

A seleção de fluoróforo espalharam os espectros de emissão tanto quanto possíveis minimizar a sobreposição espectral e, portanto, o nível de compensação pedida. Uma ferramenta online gratuita que pode ser usada para auxiliar a criação de um painel de citometria de fluxo pode ser encontrada aqui: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Para economizar espaço no espectro de emissão, utilizamos um “canal de despejo” usando um corante de viabilidade com um comprimento de onda de emissão que se sobrepõe com os da APC-H7 (conjugados para CD45RA) para habilitar a detecção (e exclusão) de ambos mortos e/ou CD45RA⁺ usando um único detector.

Aqui, um protocolo é apresentado para o isolamento de sangue periférico CD4⁺ T-células e sua subsequente análise por citometria de fluxo para determinar as proporções dos diferentes e recentemente descrito subconjuntos de circulação.

Protocol

Amostras de sangue foram obtidas de indivíduos normais (NS) (n = 12) bem como pacientes com linfoma de zona marginal (MZL) (n = 7) e outros tipos de linfoma de células B não-Hodgkin (BNHL) (FL 6 pacientes, 2 pacientes de linfoma linfoplasmacítico e 1 baixo grau B-pilha Linfoma não-Hodgkin não especificados paciente). Os pacientes foram recrutados as clínicas de Hematologia no Leicester Royal enfermaria depois de ter dado consentimento, escrito, com aprovação ética no lugar em todos os estudos. Aprovação étic…

Representative Results

CD4 alta+ pureza foi conseguida usando o CD4+ protocolo de isolamento, que era de confiança em todas as amostras de sangue testadas por nós (quer dizer: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (Figura 3). Identificação de cTfh (CD4+ CXCR5+ células) em um assunto normal representativo é apresentado(Figura 4). A proporç…

Discussion

Este protocolo representa uma forma simples e eficiente para analisar as células de cTfh de sangue periférico, permitindo a detecção de todos os subconjuntos relevantes identificados na literatura, até agora. Amostras de sangue podem ser facilmente e eficientemente obtidas como parte do padrão Clínicas ambulatoriais e seriais amostras pode ser coletada em paralelo com os dados clínicos. Por sua vez, isso permite que estudos prospectivos avaliando cTfh subconjuntos como biomarcadores para progressão da doença ou…

Materials

RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973