Mikrodialyse exzitatorischen Aminosäuren während der EEG-Ableitungen in Ratten frei beweglich

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode zur in Vivo Mikrodialyse Aspartat- und Glutamat Freisetzung im ventralen Hippocampus von epileptischen und nicht-epileptischen Ratten, in Kombination mit EEG-Ableitungen zu analysieren. Extrazelluläre Konzentrationen von Aspartat- und Glutamat können mit den verschiedenen Phasen der Erkrankung korreliert werden.

Abstract

Mikrodialyse ist eine gut etablierte Neurowissenschaften-Technik, die die Veränderungen der neurologisch Wirkstoffe diffundieren in das Gehirn zwischenräumlichen Raum mit dem Verhalten und/oder mit das konkrete Ergebnis der Pathologie (z. B. Anfälle korreliert für Epilepsie). Bei Epilepsie zu studieren, ist die Mikrodialyse-Technik oft mit kurzfristige oder auch langfristige Video-Elektroenzephalographie (EEG Überwachung zur Beurteilung von spontanen Anfall Frequenz, Schweregrad, Verlauf und clustering) kombiniert. Das kombinierte Mikrodialyse-EEG basiert auf der Verwendung von mehreren Methoden und Instrumenten. Hier führten wir in Vivo Mikrodialyse und kontinuierlichen Video-EEG-Aufzeichnung auf Monitor Glutamat und Aspartat-Abfluss im Laufe der Zeit in verschiedenen Phasen des natürlichen Verlaufs der Epilepsie in einem Rattenmodell. Dieser kombinierte Ansatz ermöglicht es, die Paarung von Änderungen in der Neurotransmitter-Freisetzung mit bestimmten Phasen der Krankheitsentwicklung und Fortschreiten. Die Aminosäure-Konzentration in das Dialysat wurde durch flüssige Chromatographie bestimmt. Hier beschreiben wir die Methoden und die Gliederung der wichtigsten eins während in Vivo Mikrodialyse Vorsichtsmaßnahmen sollten-EEG, mit besonderem Augenmerk auf der stereotaktischen Operation, basale und hohe Kalium Stimulation während der Mikrodialyse, Tiefe Elektrode EEG-Aufzeichnung und Analyse der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie Aspartat-und Glutamat in das Dialysat. Dieser Ansatz kann angepasst werden, eine Vielzahl von Drogen oder Krankheit testen induzierte Veränderungen der physiologischen Konzentrationen von Aspartat- und Glutamat im Gehirn. Abhängig von der Verfügbarkeit eines geeigneten analytischen Assay kann es weiter verwendet werden, verschiedene lösliche Moleküle zu testen, bei der EEG-Aufzeichnung zur gleichen Zeit beschäftigen.

Introduction

Um Einblick in die Funktionsbeeinträchtigung der Glutamat-vermittelte exzitatorischen und GABAergen inhibitorischen Neurotransmission spontane Anfälle im Temporallappen-Epilepsie (TLE) wodurch überwacht wir systematisch extrazelluläre Konzentrationen von GABA¹ und später die Ebenen von Glutamat und Aspartat-² durch Mikrodialyse im ventralen Hippocampus von Ratten zu verschiedenen Zeitpunkten der natürlichen Krankheit Kurs, d.h.während der Entstehung und Progression von Epilepsie. Wir nutzten die TLE Pilocarpin Modell bei Ratten, das die Krankheit sehr genau in Bezug auf Verhalten, elektrophysiologische und histopathologische Veränderungen^3,4 imitiert und wir korreliert die Dialysat Konzentration von amino Säuren, die verschiedenen Phasen: die akute Phase nach der epileptogenen Beleidigung, die Latenz-Phase, die Zeit der ersten spontanen Anfall und die chronische Phass^5,6,7. Gestaltung der Phasen der Krankheit wurde durch Langzeit-Video-EEG-monitoring und die präzise EEG und klinische Charakterisierung von spontaner Anfälle ermöglicht. Anwendung der Mikrodialyse Technik im Zusammenhang mit Langzeit Video-EEG-monitoring erlaubt uns, mechanistische Hypothesen für TLE Neuropathologie vorzuschlagen. Zusammenfassend lässt sich sagen ermöglicht die Technik beschrieben in dieser Handschrift die Paarung von neurochemischen Veränderungen innerhalb einer definierten Gehirnregion mit der Entstehung und Progression von Epilepsie im Tiermodell.

Gekoppelte Geräte, bestehend aus einer Tiefe Elektrode an eine Kanüle Mikrodialyse gegenübergestellt werden oft an Epilepsie Forschungsstudien eingesetzt wo Veränderungen der Neurotransmitter, ihrer Metaboliten oder Energie-Substrate mit neuronaler Aktivität korreliert werden sollte. In der überwiegenden Mehrheit der Fälle es ist in frei Verhalten Tiere verwendet, aber es kann auch in ähnlicher Weise in den Menschen, z. B.bei Pharmaco-resistente epileptischen Patienten Tiefe Elektrode Untersuchung vor der Operation⁸durchgeführt werden. EEG-Aufzeichnung sowohl Dialysat Sammlung kann separat durchgeführt werden (z. B.Implantation der Elektrode in einer Hemisphäre und der Mikrodialyse Sonden in die andere Hemisphäre oder sogar der Mikrodialyse in einer Gruppe von Tieren während der Durchführung das alleinige EEG in eine andere Gruppe von Tieren). Kopplung der Elektroden, Sonden müssen jedoch mehrere Vorteile: es vereinfacht stereotaktischen Chirurgie, Gewebeschäden, nur eine Hemisphäre beschränkt (wobei andererseits intakt, wie ein Steuerelement für histologische Untersuchungen), und die Ergebnisse wie diese homogenisiert ergeben sich aus der gleichen Region des Gehirns und das gleiche Tier.

Auf der anderen Seite erfordert die Vorbereitung des gekoppelten Mikrodialyse Sonde Elektrode Geräts Fähigkeiten und Zeit wenn es hausgemacht ist. Man konnte relativ hohe Mengen an Geld ausgeben, wenn vom Markt gekauft. Darüber hinaus Wenn Mikrodialyse Sonden (Prüfspitzen sind in der Regel 200-400 µm im Durchmesser und 7 bis 12 mm lang) sind⁹und EEG-Elektroden (Elektrodenspitzen sind in der Regel von 300-500 µm im Durchmesser, und lang genug um die Gehirnstruktur von Interesse¹⁰zu erreichen) gekoppelt, stellt das montierte Gerät ein sperriges und relativ schweres Objekt auf einer Seite des Kopfes, die ist für Tiere lästig und fehleranfällig, verloren zu werden, vor allem, wenn es an die Dialyse-Pumpe und die harten Draht EEG Recording-System angeschlossen ist. Dieser Aspekt ist in epileptische Tiere, die schwierig zu handhaben und weniger anpassungsfähig an die Mikrodialyse-Sitzungen sind relevanter. Richtige Operationstechniken und angemessene Nachsorge können dauerhafte Implantate, die minimale Tier Unbehagen verursachen und sollte verfolgt werden, für kombinatorische Mikrodialyse-EEG^10,11, Experimente führen ¹².

Die Vorzüge und Grenzen der Mikrodialyse Technik wurden durch viele Neurowissenschaftler im Detail überprüft. Der primäre Vorteil gegenüber anderen in Vivo Perfusion Techniken (z.B., Push-Pull-schnelle Strömung oder kortikale Tasse Perfusion) ist eine kleine Durchmesser der Sonde, die eine relativ genaue Fläche von Interesse^{13,14, 15}. Zweitens schafft die Mikrodialyse Membran eine physische Barriere zwischen dem Gewebe und dem Perfusat; Daher hochmolekularen Gewicht Substanzen nicht überqueren und nicht stören die Analyse^16,17. Darüber hinaus wird das Gewebe von der turbulenten Strömung Perfusat¹⁸geschützt. Ein weiterer wichtiger Vorteil ist die Möglichkeit, Perfusat Fluss zur Maximierung der Analyt-Konzentration in der Perfusat ändern (d. h., der Prozess der Mikrodialyse können mathematisch wohldefinierte und können geändert werden, um hohe Ausbeute Konzentration des Analyten in der Probe)¹⁹. Schließlich kann die Technik, Drogen oder pharmakologisch wirksamer Substanzen in das Gewebe von Interesse zu ziehen und ihre Wirkung am Ort der Intervention²⁰bestimmen verwendet werden. Auf der anderen Seite hat Mikrodialyse zeitlich begrenzte Auflösung (in der Regel mehr als 1 min aufgrund des Zeitaufwands für Probenahmen) im Vergleich zu elektrochemischen oder biologischen Sensoren; Es ist eine invasive Technik, die Gewebeschäden verursacht; Es beeinträchtigt die neurochemische Gleichgewicht in den Raum um die Membran durch die kontinuierliche Konzentration Steigung von allen löslichen Substanzen tritt die Perfusat zusammen mit den Analyten von Interesse. Zu guter Letzt ist die Mikrodialyse-Technik stark beeinflusst durch die Grenzen der analytischen Techniken für die Quantifizierung von Substanzen im Perfusat^9,21,22,23 . Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) nach Derivatisierung mit Orthophthaldialdehyde für Glutamat und Aspartat-Analyse in biologischen Proben gut validierte^{24,25,26 wurde , 27} und seine umfangreiche Diskussion ist außerhalb des Bereichs dieser Handschrift, aber die Daten, die mit dieser Methode werden im Detail beschrieben werden.

Wenn richtig und ohne Änderungen der Zusammensetzung Perfusat durchgeführt, bieten Mikrodialyse verlässlichen Informationen über den basalen Ebenen der Freisetzung von Neurotransmittern. Der größte Teil der basalen Ebenen ist wahrscheinlich das Ergebnis Sender Spillover aus den Synapsen-⁹. Da die einfache Probenahme des Neurotransmitters im extra synaptischen Raum in vielen Fällen nicht ausreichen, um die Ziele einer Untersuchung zu verfolgen ist, kann die Mikrodialyse-Technik auch Neuronen stimulieren oder für sie wichtige berauben eingesetzt werden physiologischen Ionen wie K⁺ oder Ca^{2 +}, um hervorrufen oder verhindern die Freisetzung des Neurotransmitters.

Hohe K⁺ -Stimulation ist oft in Neurobiologie zur neuronalen Aktivität nicht nur wach Tiere, sondern auch in Grund- und organotypischen Kulturen zu fördern. Die Belichtung ein gesundes zentrales Nervensystem zu Lösungen mit hohen Konzentrationen von K⁺ (40-100 mM) erinnert an die Fluth von Neurotransmittern²⁸. Diese Fähigkeit von Nervenzellen, eine zusätzliche Freisetzung als Reaktion auf hohe K⁺ möglicherweise epileptische Tiere¹ und in anderen neurodegenerativen Krankheiten^29,30gefährdet. Ebenso die Ca^{2 +} Entzug (durch Vorrichtung Ca^{2 +} kostenlose Lösungen erhalten) verwendet wird, um Kalzium-abhängige zu etablieren-release von die meisten Neurotransmitter Mikrodialyse gemessen. Es wird allgemein angenommen, dass Ca^{2 +} abhängige Release neuronalen Ursprungs, während Ca^{2 +} unabhängige Freisetzung aus Glia stammt, aber viele Studien Kontroverse über die Bedeutung von Ca^{2 hoben +}-empfindliche Messungen von z.B. Glutamat oder GABA⁹: also, wenn möglich, es empfiehlt sich, Mikrodialyse Studien mit Reinstraum Studien zu unterstützen, da diese letztere haben eine höhere räumliche Auflösung und die Elektroden näher an Synapsen³¹.

Bei epileptischen Mikrodialyse Tierstudien ist es wichtig zu betonen, dass die meisten von ihnen gewonnenen Daten verlassen sich auf video oder Video-EEG Überwachung der Anfälle, d. h., das vorübergehende Auftreten von Anzeichen oder Symptome durch abnorme übermäßige oder synchrone neuronaler Aktivität im Gehirn³². Es gibt einige Besonderheiten der elektrographischen Anfälle bei Tieren Pilocarpin behandelt, die berücksichtigt werden sollten, wenn Sie das Experiment vorbereiten. Spontane Anfälle treten in Clustern^33,34und deprimiert Tätigkeit mit häufigen EEG korreliert Spitzen³ folgt. Schein operierten nicht-epileptische Tiere Beschlagnahme-ähnliche Aktivität³⁵ aufweisen können sollte und daher die Parameter für EEG-Aufnahmen Bewertung standardisierte³⁶ und, wenn möglich, sollte das Timing der Mikrodialyse Sitzungen gut definiert werden. Zu guter Letzt empfehlen wir nach den Prinzipien und methodische Standards zur Video-EEG Überwachung bei Erwachsenen Nagetieren Kontrolle von Experten der internationalen Liga gegen Epilepsie und amerikanischen Epilepsie Gesellschaft in ihren jüngsten Berichten^{37 beschrieben. ,38}.

Hier beschreiben wir Mikrodialyse Glutamat und Aspartat-parallel mit der langfristigen Video-EEG-Ableitungen epileptische Tiere und deren Analyse in das Dialysat durch HPLC. Wir werden die entscheidenden Schritte des Protokolls zu betonen, die man für das beste Ergebnis kümmern sollte.

Protocol

Alle experimentelle Verfahren von der University of Ferrara institutionelle Animal Care and Use Committee und vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt worden (Autorisierung: d.m. 246/2012-B) im Einklang mit den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des 24. November 1986 (86/609/EWG). Dieses Protokoll ist speziell für Glutamat und Aspartat-Bestimmung in Ratte Gehirn Dialysates gemäß EEG Kontrolle der Mikrodialyse Sitzungen bei epileptischen und nicht-epileptischen Ratten erhaltenen angepasst…

Representative Results

Sonde Erholung Die mittlere Erholung (d. h. die mittlere Aminosäuregehalt im Perfusat als Prozentsatz des Inhalts in ein gleiches Volumen der Durchstechflasche Lösung) war 15,49 ± 0,42 % bei einer Durchflussmenge von 2 μl/min und 6,32 ± 0,64 bei 3 μl/min für Glutamat und 14.89 ± 0,36 % bei einer Durchflussmenge von 2 Μl/min und 10,13 ± 0,51 bei 3 μl/min für Aspartate bei Verwendung der Cuprophane-Membran-Sonde…

Discussion

In dieser Arbeit zeigen wir, wie eine kontinuierliche Video-EEG-Aufzeichnung gepaart mit Mikrodialyse in einem experimentellen Modell der TLE durchgeführt werden kann. Video-EEG-Aufzeichnung Techniken werden verwendet, um die verschiedenen Phasen der Fortschreiten der Krankheit bei Tieren korrekt zu diagnostizieren und die Mikrodialyse-Technik wird verwendet, um die Änderungen in Release Glutamat zu beschreiben, die rechtzeitig auftreten (keine Änderungen für wurden gefunden Aspartate in einer zuvor veröffentlichten…

Materials

3-channel two-twisted electrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
guide cannula	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	MAB 4.15.IC	Material
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Xylazine	Sigma, Milano, Italy	X1251	Material
Isoflurane-Vet	Merial, Toulouse, France	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 mg/ ml – tramadol	Formevet, Milano, Italy	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine	MSD Italia, Roma, Italy	20891077 (AIC)	Material
simplex rapid dental cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kyoto, Japan	PN1167	Material
probe clip holder	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	p/n 100 5001	Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml – diazepam	Roche, Monza, Italy	019995063 (AIC)	Material
1 mL syringe with 25G needle	Vetrotecnica, Padova, Italy	11.3500.05	Material
rat flexible feeding needle 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
digital video surveillance system	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	Equipment
microdialysis probe	Agn Tho's, Lindigö Sweden	MAB 4.15.1.Cu	Material
microdialysis probe	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA	S-8010	Material
block heater	Grant Instruments, Cambridge, England	QBD2	Equipment
stirrer	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	Equipment
infusion pump	Univentor, Zejtun, Malta	864	Equipment
fine bore polythene tubing	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Material
blue tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1002	Material
red tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1003	Material
2.5 mL syringe with 22G needle	Chemil, Padova, Italy	S02G22	Material
vial cap	Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic	VCA-1004TB-100	Material
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	Material
glass insert with bottom spring	Supelco, Sigma, Milano, Italy	27400-U	Material
autosampler vial	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy	C4013-2	Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit	Knauer, Berlin, Germany	V7602	Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump	Knauer, Berlin, Germany	V7603	Equipment
spectrofluorometric detector	Shimadzu, Kyoto, Japan	RF-551	Equipment
chromatogrphic column	Knauer, Berlin, Germany	25EK181EBJ	Material
chromatogrphic pre-column	Knauer, Berlin, Germany	P5DK181EBJ	Material
mobile phase solution A	0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0		Solution
mobile phase solution B	40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5		Solution
Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
modified Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
saline	0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0		Solution
sucrose solution	10% sucrose in distilled water		Solution