Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa
Summary
Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.
Abstract
Studi recenti di cellule intere patch-clamp da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) hanno fornito un grande corpo di informazioni circa i meccanismi spinali trasmissione sensoriale, regolamento nocicettivo e sviluppo cronico dolore o prurito. Implementazioni di registrazioni elettrofisiologiche insieme a studi morfologici basati sull’utilità delle fette acute del midollo spinale hanno ulteriormente migliorato la nostra comprensione delle proprietà di un neurone e la composizione dei circuiti locali in SG. Qui, presentiamo una guida dettagliata e pratica per la preparazione di fettine di midollo spinale e visualizza rappresentativo della intero-cellula registrazione e risultati morfologici. Questo protocollo permette ideale conservazione neuronale e può imitare le condizioni in vivo in una certa misura. In sintesi, la capacità di ottenere una preparazione in vitro di fettine di midollo spinale permette stabile a corrente e tensione morsetto registrazioni e così potrebbe facilitare le indagini dettagliate nelle proprietà intrinseche della membrana, circuiti locali e struttura di un neurone utilizzando diversi approcci sperimentali.
Introduction
La sostanza gelatinosa (SG, della lamina II del corno dorsale spinale) è un centro di relè indiscutibilmente importante per la trasmissione e regolazione informazioni sensoriali. Si compone di interneuroni inibitori ed eccitatori, che ricevono gli input dalle fibre afferenti primarie, interneuroni locali e il sistema inibitorio discendente1endogeno. Negli ultimi decenni, lo sviluppo di preparazione fetta acuta del midollo spinale e l’avvento della registrazione della intero-cellula patch-clamp hanno permesso diversi studi sulle proprietà elettrofisiologiche e morfologiche intrinseche di SG neuroni2, 3 , 4 così come gli studi dei circuiti locali in SG5,6. Inoltre, utilizzando la preparazione di fetta del midollo spinale in vitro , i ricercatori in grado di interpretare i cambiamenti in un neurone excitabilities7,8, la funzione dello ione canali9,10, e attività sinaptica11,12 in varie condizioni patologiche. Questi studi hanno approfondito la nostra comprensione del ruolo che i neuroni SG svolgono nello sviluppo e mantenimento del dolore cronico e prurito neuropatico.
Essenzialmente, il presupposto fondamentale per ottenere una chiara visualizzazione di soma neuronale e ideale della intero-cellula patch usando le fette acute del midollo spinale è garantire l’eccellente qualità delle fette così sani e patchable neuroni possono essere ottenuti. Tuttavia, preparando fettine di midollo spinale prevede diversi passaggi, ad esempio eseguendo un laminectomy ventrale e rimuovere la membrana di pia-aracnoide, che può essere ostacoli nell’ottenere fette sani. Sebbene non sia facile da preparare fettine di midollo spinale, esecuzione di registrazioni in vitro su fettine di midollo spinale ha diversi vantaggi. Rispetto alle preparazioni di cultura di cellule, fettine di midollo spinale possono conservare parzialmente inerente connessioni sinaptiche che sono in una condizione fisiologicamente rilevante. Inoltre, cellule intere patch-clamp registrazione con fettine di midollo spinale potrebbe essere combinata con altre tecniche, quali patch doppio morsetto13,14, studi morfologici15,16 e unicellulare RT-PCR 17. Pertanto, questa tecnica fornisce ulteriori informazioni su che caratterizzano le diversità anatomiche e genetiche in una regione specifica e consente di indagine della composizione dei circuiti locali.
Qui, forniamo una descrizione di base e di dettagliata del nostro metodo per preparare fette acute del midollo spinale e l’acquisizione di registrazioni di cellule intere patch-clamp da neuroni di SG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo dettagli i passaggi per la preparazione di fettine di midollo spinale, che abbiamo utilizzato con successo durante gli esperimenti di cellule intere patch-clamp su SG neuroni18,19,20,21. Mediante l’implementazione di questo metodo, abbiamo recentemente riportato che la minociclina, una seconda generazione di tetraciclina, marcatamente potrebbe migliorare la trasmissione sinapt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (No. 81560198, 31660289).
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
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