Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme
Summary
Burada fare vivo biotin ile glomerular hücre yüzey proteinlerin etiketleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu protokolü nasıl fare böbrekler sıvı, glomeruli ayırma ve ilgi proteinin endojen immunoprecipitation gerçekleştirmek yönergeler içerir.
Abstract
Proteinüri Poşlu endotel, glomerular membran ve podocytes onların yarık zarlar ile oluşan glomerular filtre bozulma oluşur. Glomerular filtre, özellikle yarık diyafram, narin yapısı farklı hücre yüzey proteinleri etkileşimi üzerinde dayanır. Bu hücre yüzey proteinleri eğitim defa vitro çalışmalar veya histolojik analiz için sınırlı olmuştur. Burada, glomerular hücre yüzey proteinleri fizyolojik ve etyopatogenezi koşullar altında çalışma sağlayan yöntem, etiketleme bir fare içinde vivo biotinylation mevcut. Bu iletişim kuralı fare böbrekler sıvı, glomeruli ayırma ve ilgi bir proteinin endojen immunoprecipitation gerçekleştirme hakkında bilgi içerir. Yarı Nefelometri glomerular hücre yüzey bereket hazır bu roman yöntemi ve tüm proteinler biotin perfüzyon için erişilebilir olduğunu ve immunoprecipitation okudu. Buna ek olarak, izolasyon-in glomeruli ya da biotinylation olmadan daha fazla çözümleme glomerular RNA ve protein hem de birincil glomerular hücre kültürü (Yani, birincil podocyte hücre kültürü) sağlar.
Introduction
Proteinüri glomerular yaralanma özelliğidir ve genellikle glomerular filtre1bozulma eşlik eder. Glomerular filtre Poşlu endotel, glomerular membran ve podocytes oluşur. Glomerular filtre hassas moleküler yapısını son derece dinamik hücre yüzey protein hem sağlıklı ve hastalıklı böbrekler2,3,4,5‘ te,6 kaçakçılığı olup . Endositoz hücre yüzey proteinlerin podocytes7yaşam için temel olarak gösterilmiştir. Nephrin ve podocalyxin podocytes ifade edilen transmembran proteinler vardır. Podocalyxin bir sialoglycoprotein podocytes8,9,10ikincil ayak süreçlerinin kaplama ise Nephrin glomerular yarık diyafram belkemiğidir. Endositik kaçakçılığı daha önce nephrin podocalyxin3,11,12,13,ve14için gösterilmiştir.
Bizim bilgi en iyi şekilde, endositoz hücre yüzey proteinlerin henüz literatürde glomerular endotel hücrelerinde tarif edilmiştir değil. Ancak, endotel hücreleri genel olarak tüm gerekli proteinler endositoz (Yani, clathrin bağımlı, Sal-bağımlı endositoz)15,16farklı türleri için hızlı. Bu nedenle, endotel hücre yüzey kaçakçılığı, örneğin, vasküler endotel (VE) kullanarak bu yöntemle ele-cadherin ve hücre içi adezyon molekülü (ICAM-2) bir hücre olarak yüzey glomerular endotel hücreleri17 için işaretleyici protein .
Ne yazık ki, hiçbir doğru vitro modeli hangi hücre yüzey proteini kaçakçılığı okudu olabilir hassas üç katmanlı glomerular filtresi vardır. Böylece bu yöntemin hedeftir glomerular protein kaçakçılığı vivo içindeçalışmaya. Ayrıca, bu iletişim kuralını glomeruli, daha da glomerular RNA, proteinler veya hücre Analizi etkinleştirme izole konularında bilgi sağlar. Farklı tarafından açıklanan teknikleri benzer glomerular yalıtım18,19gruplandırır.
Daha önce biz ve diğerleri ex vivo glomerular hücre yüzey proteinlerin biotinylation2,3,4,20,21tarafından etiketleme kullandık. Ancak, bu ex vivo yöntemde, izole glomeruli endositik ticareti etkileyebilecek mekanik stres maruz bırakıldı. Alternatif olarak, glomerular hücre yüzey proteinlerin ayirt etiketleme kapsamlı edebiyat2,20,22yılında kullanılmıştır. Bu yöntemle ancak, az sayıda protein bir slayt içinde analiz edilebilir ve Nefelometri ayirt görüntülerin genellikle zordur.
Bu roman vivo Yöntem glomerular hücre yüzey proteini bolluk ve kaçakçılığı doğru içinde sağlıklı ve hastalıklı böbrekler çalışmaya güvenilir bir aracı sunuyor ve ek olarak ayirt testleri kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan Yöntem glomerular RNA veya protein araştırmak için glomeruli başarılı yalıtım sağlar. Buna ek olarak, birincil glomerular hücre kültürlerinde izole glomeruli gerçekleştirilir. Biotin glomerular yalıtım daha önce uyguladıysanız, glomerular hücre yüzey proteinlerin etiketleme gerçekleştirilebilir. Bu yöntemle vivo içinde glomerular hücre yüzey proteini kaçakçılığı okudu ve protein bereket yarı Nefelometri mümkündür. Başarıyla glomerular hücre yüzey proteini bereket…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Blanka Duvnjak onun olağanüstü teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 M.W. ve QU280/3-1 için IQ tarafından desteklenmiştir Sermaye sağlayıcı çalışma tasarım, veri toplama, veri analizi, yayımlamaya karar ve el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein–nephrin–is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
