Как определить долю флуоресцентных белков Photoactivated навалом и в живых клеток
Summary
Здесь мы представляем протокол, который включает в себя генетически спаренных спектрально собственный photoactivatable и флуоресцентных белков. Эти флуоресцентный белок химер количественной фракции ПА-FP, это photoactivated быть флуоресцентные, т.е., photoactivation эффективность. Протокол показывает, что различные виды photoactivation принести различные photoactivation эффективность.
Abstract
Photoactivatable и – кабриолет флуоресцентных белков (ПА-FPs) использовались в микроскопии флуоресцирования клеток для анализа динамики клеток и белков ансамблей. До настоящего времени, метод не был доступен для количественного определения навалом и в живой клетки, как многие из ПА-FPs выразили являются photoactivated флюоресцируют.
Здесь мы представляем протокол с участием внутренних правителей, т.е., генетически связан флуоресцентные белки спектрально собственный (photoactivatable), ratiometrically количественно доля всех ПА-FPs, выраженные в ячейку, включаются в флуоресцентные. Используя этот протокол, мы показываем, что различные виды photoactivation принесли различные photoactivation эффективность. Коротких мощных photoactivation с конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM) привели к до четыре раза ниже photoactivation эффективность чем сотни низкого уровня воздействия применяются CLSM или короткого импульса, применяемые widefield освещения. Хотя протокол был примером здесь (ПА-) GFP и (ПА-) вишня, он может в принципе применяться к любой спектрально собственный пары флуоресцентный белок photoactivatable или photoconvertible и любой экспериментальной установки.
Introduction
В 2002 году были описаны первый широко применимым photoactivatable (1ПА-GFP) и photoconvertible (2Каэдэ) флуоресцентных белков. Эти оптические маркера флуоресцентные белки изменить их спектральных свойств после облучения УФ-светом, то есть, они становятся яркими (photoactivatable флуоресцентные белки, т.е., PA-FPs), или изменить их цвет (photoconvertible FPs). На сегодняшний день, несколько обратимого и необратимого photoactivatable и photoconvertible флуоресцентные белки были развитыми3,4. В ансамбль или массовых исследований оптические маркеры используются для изучения динамики ячейки целиком или белки и подключение субцеллюлярные отсеков. Кроме того оптические маркеры включен один молекулы на основе сверхразрешение методы, такие как PALM5 и6FPALM визуализации.
Хотя фотохимических процессов во время photoactivation – преобразование или были описаны многие оптические маркеры и даже кристаллографических структур до и после photoactivation, / – преобразования были сделаны доступно7 , 8, Фотофизический механизм photoactivation и – преобразования полностью не поняты. Кроме того, до настоящего времени только сырая оценки существует эффективности photoactivation и – преобразование, то есть, часть флуоресцентных белков, выразил это на самом деле photoconverted или photoactivated быть флуоресцентные. В vitro исследования ансамбль сообщалось количественной оценки изменения спектров поглощения и объем встроенной и активированного протеина в гель9,10,11.
Здесь мы представляем протокол с участием флуоресцентный белок химер оценить долю флуоресцентных белков photoactivated навалом и в живых клеток. Всякий раз, когда работа с генетически закодированный флуоресцентных белков, абсолютное количество белка выразил варьируется от ячейки к ячейке и неизвестна. Если одну ячейку, выражая ПА-FP показывает сигнал ярче после photoactivation чем другой ячейки, не смогите быть продифференцировано, если это ярче сигнала из-за выше выражение ПА-FP или более эффективным photoactivation PA-FP. Чтобы стандартизировать выражение уровня в клетках, мы представляем внутренней правителей генетически спаренных спектрально собственный флуоресцентных белков. Путем сцепления генетической информации о photoactivatable флуоресцентный белок спектрально собственный всегда на флуоресцентные белки, внутренние правители создаются, будет по-прежнему выражена неизвестного общую сумму, но в фиксированной и известных относительное количество 1: 1. Эта стратегия позволяет количественная характеристика различных схем УФ света photoactivation, т.е. оценку относительного объема PA-FPs, который может быть photoactivated с различными видами photoactivation и тем самым позволяет определение photoactivation схемы, которые являются более эффективными, чем другие. Кроме того эта стратегия позволяет в принципе оценки абсолютной количественной оценки доли photoactivated ПА-FP. В этой связи важно понимать, что представленные ансамбль исследования на основе интенсивности который делает анализ более сложные, изложенные в настоящем Протоколе. Параметры определения измерений интенсивности флуоресценции, т.е. различных молекулярных яркость, поглощения и выбросов спектры и эффекты ладу, необходимо учитывать при сравнении интенсивности флуоресценции различных флуоресцентных белков.
Представлены ratiometric на основе интенсивности количественной оценки эффективности photoactivation является примером для PA-GFP и ПА-вишня в живых клеток, но в принципе широко применимым и может быть использован для любого photoactivatable флуоресцентный белок при любых экспериментальные условия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пока метод не существовало навалом определить долю PA-FPs в живых клеток, photoactivated быть флуоресцентные. Представленные протокол может использоваться для любой пары спектрально собственный флуоресцентный белок. Хотя здесь примером для необратимого ПА-FPs ПА-GFP и ПА-вишня, этот подход являет?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Дориго лабораторные и Imaging службы неврологии в Стэнфордский Школы медицины университета для предоставления оборудования и пространства для этого проекта.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
