Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo
Summary
Se describe un método de usar polietilamina (PEI)-recubierto de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas para transfectar macrófagos con ARNsi. Estas nanopartículas pueden administrar siRNA a macrófagos in vitro y en vivo y silencio blanco genes.
Abstract
Debido a su papel fundamental en la regulación de la respuesta inmune, macrófagos han sido continuamente objeto de intensa investigación y representan una prometedora diana terapéutica en muchos trastornos, como enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y cáncer. Silenciamiento génico mediado por RNAi es un valioso enfoque de elección para probar y manipular la función del macrófago; sin embargo, la transfección de macrófagos con siRNA se considera a menudo ser técnicamente difícil, y, en la actualidad, existen metodologías pocos dedicados a la transferencia de siRNA a macrófagos. Aquí, presentamos un protocolo del uso de nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético revestido polietilamina (PEI-SPIONs) como un vehículo para la entrega específica de siRNA a los macrófagos. PEI-SPIONs son capaces de atascamiento y condensación completamente siRNA cuando la relación de peso de Fe: siRNA alcanza 4 y arriba. In vitro, estas nanopartículas pueden brindar de manera eficiente siRNA primarios macrófagos, así como de la línea celular RAW 264.7 de macrófago-como, sin comprometer viabilidad celular en la dosis óptima para la transfección, y, en última instancia, inducen objetivo mediado por siRNA silenciamiento génico. Además de ser utilizados para la transfección en vitro siRNA, PEI-SPIONs son también una herramienta prometedora para la entrega de siRNA a macrófagos en vivo. Teniendo en cuenta sus características combinadas de propiedades magnéticas y la capacidad de silenciamiento génico, sistémico administradas partículas PEI-SPION/siRNA se espera que para modular la función de macrófagos, pero también para activar macrófagos ser fotografiada y seguimiento. En esencia, PEI-SPIONs representan una plataforma sencilla, segura y eficaz nonviral para entrega de siRNA a macrófagos in vitro e in vivo.
Introduction
Los macrófagos son un tipo de células inmunes innatas distribuidos en todos los tejidos del cuerpo, aunque en diferentes cantidades. Produciendo una variedad de citoquinas y otros mediadores, que desempeñan papeles críticos en la defensa del huésped contra los invasores patógenos microbianos, en reparación de los tejidos posterior a la lesión y en el mantenimiento de la homeostasis del tejido1. Debido a su importancia, los macrófagos han sido continuamente objeto de intensa investigación. Sin embargo, a pesar de su prevalencia en estudios de la función y Regulación génica, silenciamiento génico mediado por siRNA es menos probable que tenga éxito en macrófagos porque estas células — particularmente, los macrófagos primarios — son a menudo difíciles transfectar. Esto se puede atribuir a un relativamente alto grado de toxicidad asociado con enfoques de transfección más bien establecidos en la cual la membrana celular es químicamente (por ejemplo, con polímeros y lípidos) o físicamente (p. ej., por electroporación y pistolas de genes) interrumpen dejó siRNA moléculas cruzan la membrana, reduciendo así drásticamente viabilidad2,3 de macrófagos. Además, los macrófagos son los fagocitos dedicados ricos en enzimas degradativas. Estas enzimas pueden dañar la integridad de los siRNA, debilitando su eficacia silenciar aunque específicos de genes siRNA se ha entregado en la célula3,4. Por lo tanto, un sistema de envío eficaz orientada a macrófago siRNA necesita proteger la integridad y estabilidad del siRNA durante el plazo de expedición4.
Es cada vez más evidente que los macrófagos disfuncionales están implicados en la iniciación y la progresión de ciertos trastornos clínicos comunes como enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y cáncer. Por esta razón, modulando la función del macrófago con, por ejemplo, siRNA, ha ido surgiendo como una metodología atractiva para el tratamiento de estos trastornos5,6,7. Aunque se ha progresado mucho, un gran reto de la estrategia de tratamiento basada en el siRNA es la especificidad celular pobre de siRNA sistémico administrado y la siRNA insuficiente captación por los macrófagos, que por lo tanto dar lugar a efectos secundarios indeseados. En comparación con la terapéutica de ácido nucleico libre que generalmente carecen de selectividad óptima de la célula y a menudo conducen a efectos adversos, cargado de droga nanopartículas (NPs), debido a su propensión espontánea de ser capturado por el sistema reticuloendotelial, fuera del objetivo puede diseñarse para apuntar pasivo a macrófagos en vivo, lo que permite mayor eficacia terapéutica con efectos secundarios mínimos8. NPs actuales para la entrega de las moléculas de ARN son nanocarriers inorgánicos y liposomas varios polímeros9. Entre ellos, polietilamina (PEI), un tipo de polímeros catiónicos capaces de atar y condensación de los ácidos nucleicos en NPs estabilizados, muestra el ARN más alta entrega capacidad9,10. PEI protege los ácidos nucleicos de la degradación enzimática y nonenzymatic media a su transferencia a través de la membrana celular y promueve su liberación intracelular. Aunque inicialmente introducido como un reactivo de entrega ADN, PEI fue demostrado posteriormente para ser una plataforma atractiva para en vivo siRNA entrega, ya sea local o sistémicamente9,10.
Nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIONs) han demostrado gran promesa en biomedicina, debido a sus propiedades magnéticas, biocompatibilidad, tamaño comparable a objetos biológicamente importantes, alta relación superficie-área-volumen y se adapta fácilmente superficie para bioterrorismo anexo11. Por ejemplo, debido a su utilidad potencial como un agente de contraste y una rápida captación por los macrófagos, SPIONs han surgido como una herramienta clínica favorita a imagen de los macrófagos de tejido12. SPIONs también se han estudiado ampliamente como ácido nucleico entrega vehículos11,13,14,15, a nuestro conocimiento, la literatura contiene algunos informes de SPIONs como un portador para el entrega de siRNA dirigidos a macrófagos. Para la entrega del gene de SPIONs, su superficie es generalmente cubierta con una capa de polímeros catiónicos hidrofílicos en que cargado negativamente los ácidos nucleicos puede ser electrostático atraídos y atados. Aquí, presentamos un método para sintetizar SPIONs cuya superficie se modifica con bajo peso molecular (10 kDa), ramificado PEI (PEI-SPIONs). Estos nanoplatforms magnéticas se emplean entonces para condensar siRNA, formando complejos de PEI-SPION/siRNA que permiten transporte de siRNA en las células. Razón fagocitosis espontánea de SPIONs por las células del sistema reticuloendotelial16, junto con la capacidad fuerte de la Unión y condensación de los ácidos nucleicos por PEI, hace conveniente para el transporte eficiente de siRNA en PEI-SPIONs macrófagos. Los datos aquí presentados apoyan la viabilidad de silenciamiento del gen PEI SPION/siRNA-mediada por macrófagos en cultivo como en vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los macrófagos son refractarios a transfectar por enfoques nonviral utilizados, tales como especies de lípidos, liposomas catiónicos y electroporación. Aquí describimos un método confiable y eficiente para transfectar macrófagos con ARNsi. Mediante el presente Protocolo, sobre 90% de macrófagos RAW 264.7 células (figura 2B) y de los macrófagos peritoneales de rata18 puede ser transfectado con siRNA sin deterioro significativo de la viabilidad celular. Este m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81772308) y el nacional de investigación clave y programa de desarrollo de China (Nº 2017YFA0205502).
Materials
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
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