Identificazione di Coding e classi di RNA Non codificanti espressa in suina sangue intero
Summary
Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l’elaborazione di codifica (mRNA) e non codificanti (ncRNA) globina ridotta RNA-seq librerie da un campione di sangue intero singolo.
Abstract
L’avvento di sempre più potenti e innovative tecniche di sequenziamento di generazione successiva ha aperto nuove strade nella capacità di esaminare l’espressione genica sottostanti relazionato ai processi biologici di interesse. Queste innovazioni non solo permettono ai ricercatori di osservare l’espressione delle sequenze di mRNA che codificano per geni che funzione cellulare di effetto, ma le molecole di RNA (ncRNA) non codificanti che rimangono non tradotte, ma ancora hanno anche funzioni di regolamentazione. Anche se i ricercatori hanno la possibilità di osservare l’espressione di mRNA e di ncRNA, era consuetudine per uno studio di concentrarsi su uno o l’altro. Tuttavia, quando gli studi sono interessati nell’espressione di mRNA e di ncRNA, molte volte usano campioni separati per esaminare o codifica o non-codificazione RNAs a causa della differenza nelle preparazioni di biblioteca. Questo può portare alla necessità di più campioni che può aumentare il tempo, materiali di consumo e lo stress degli animali. Inoltre, può causare i ricercatori a decidere di preparare i campioni per sola analisi, solitamente il mRNA, limitando il numero di domande biologiche che possono essere studiate. Tuttavia, ncRNAs estendersi su più classi con ruoli regolatori che espressione di mRNA di effetto. Perché ncRNA sono importanti per i processi biologici fondamentali e disordine di questi processi in durante l’infezione, possono, pertanto, fare obiettivi attraenti per terapeutica. Questo manoscritto viene illustrato un protocollo modificato per la generazione mRNA e non codificanti RNA librerie di espressione, tra cui RNA virale, da un singolo campione di sangue intero. Ottimizzazione del presente protocollo, migliorato purezza RNA, aumentata di legatura per recupero di RNAs metilato e omesso selezione di dimensioni, per consentire la cattura di altre specie di RNA.
Introduction
Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è emerso come un potente strumento per lo studio dei cambiamenti che si verificano a livello genomico di organismi biologici. Preparazione del campione per i metodi di NGS può essere variata a seconda del microrganismo, tipo di tessuto, e soprattutto le domande i ricercatori sono desiderosi di indirizzo. Molti studi sono rivolti a NGS come mezzo per studiare le differenze nell’espressione genica tra gli Stati come individui sani e malati1,2,3,4. Il sequenziamento di prendere posto su una base di intero genoma e consente un ricercatore di catturare la maggior parte, se non tutte, le informazioni genomiche per un marcatore genetico particolare in un momento indicano.
I marcatori più comuni dell’espressione osservati sono il RNA messaggero (mRNA). Le procedure più usate per le librerie durante la preparazione per RNA-seq sono ottimizzate per il recupero di molecole di mRNA mediante l’utilizzo di una serie di purificazioni, frammentazioni e legature5,6. Tuttavia, la decisione su come un protocollo dev’essere eseguito si basa pesantemente sul tipo di campione e le domande circa il campione ha detto. Nella maggior parte dei casi viene estratto il RNA totale; Eppure, non tutte le molecole di RNA sono di interesse e in casi come gli studi di espressione di mRNA eccessivamente abbondanti specie di RNA, come RNA ribosomiale (rRNA) devono essere rimossi per aumentare il numero di trascrizioni rilevabili connesso con i mRNA. Il metodo più popolare e ampiamente utilizzato per rimuovere le molecole di rRNA abbondante è la riduzione delle trascrizioni di poliadenilazione RNA denominato polyA svuotamento7. Questo approccio funziona bene per l’analisi dell’espressione di mRNA come non influenza i trascritti di mRNA. Tuttavia, negli studi che sono interessati a RNA non codificante o virale, deplezione di polyA rimuove anche queste molecole.
Molti studi scelgono di concentrarsi sulla preparazione libreria sequenza di RNA per esaminare sia espressione di mRNA (codifica) o una particolare classe di grande o piccolo RNA non codificanti. Anche se ci sono altre procedure8 come la nostra che consentono la preparazione di campioni doppi, molti studi preparano librerie da campioni separati per studi separati quando disponibile. Per uno studio come il nostro, ciò richiederebbe normalmente più campioni di sangue, aumentando il tempo, materiali di consumo e lo stress degli animali. L’obiettivo del nostro studio è stato quello di essere in grado di utilizzare sangue intero da animali per identificare e quantificare le diverse classi di entrambi mRNA e RNA non codificanti espressi tra sano e patogenicità suina virus riproduttivo e respiratorio sindrome (HP-PRRSV) ha sfidato suini9,10 pur avendo solo un campione di sangue intero singolo (2,5 mL) da ogni suino. Per fare questo, abbiamo bisogno di ottimizzare l’estrazione tipica e protocolli di creazione di librerie per generare i dati appropriati per consentire analisi di mRNA e di non-codificanti RNA (ncRNA) espressione11 da un singolo campione.
Ciò ha richiamato la necessità di un protocollo che ha permesso per mRNA e analisi di RNA non codificante perché il kit standard disponibili e metodi per la creazione di estrazione del RNA e la biblioteca sono stati destinati principalmente al mRNA e utilizzano una deplezione di poly-A passaggio12. Questo passaggio avrebbe reso impossibile il recupero di RNA non codificante o trascrizioni virali dal campione. Di conseguenza, era necessario un metodo ottimizzato che ha permesso per estrazione di RNA totale senza svuotamento polyA campione. Il metodo presentato in questo manoscritto è stato ottimizzato per consentire l’uso di sangue intero come tipo di campione e di costruire librerie di sequenziamento per sia mRNA che ncRNAs di piccole e grandi dimensioni. Il metodo è stato ottimizzato per consentire l’analisi di RNA non codificanti rilevabili tutti così come mantenere il RNA virale per successive indagini13. In tutto, il nostro protocollo di preparazione libreria ottimizzata consente per l’indagine di più molecole di RNA da un campione di sangue intero singolo.
L’obiettivo generale dietro l’uso di questo metodo era quello di sviluppare un processo che ha permesso per la raccolta di non-codificanti RNA sia mRNA da un campione di sangue intero. Questo ci permette di avere mRNA, ncRNA e RNA virale per ogni animale nel nostro studio provengono da un singolo campione9. Questo, in definitiva, consente più scientifico scoperta senza costi aggiuntivi di animale e dà un quadro più completo dell’espressione di ogni singolo campione. Il metodo descritto consente per l’esame dei regolatori dell’espressione genica, nonché a consentire per il completamento degli studi correlativi confrontando entrambi mRNA e l’espressione di RNA non codificanti utilizzando un campione di sangue intero singolo. Il nostro studio ha utilizzato questo protocollo per esaminare i cambiamenti nell’espressione genica e possibili regolatori epigenetici in viralmente infettato 9 – settimana-vecchi maschi maiali commerciali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il primo passo fondamentale nel protocollo che rendeva ottimizzato inclusa la procedura di svuotamento della globina aggiunto, che ha permesso di ottenere letture di qualità da campioni di sangue intero. Una delle più grandi limitazioni sull’utilizzo di sangue intero in studi di sequenziamento sono il numero elevato di letture nel campione che mappa alle molecole della globina e ridurre le letture che potrebbero mappe ad altre molecole di interesse18. Pertanto, nell’ottimizzare il protocollo per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta principalmente dalla da USDA catino AFRI 2013-67015-21236 e in parte da USDA catino AFRI 2015-67015-23216. Questo studio è stato sostenuto in parte da un appuntamento al agricole ricerca servizio ricerca partecipazione programma amministrato dall’Istituto Oak Ridge per scienza e formazione (ORISE) attraverso un accordo tra agenzie tra il dipartimento dell’energia ( DOE) e il dipartimento dell’agricoltura statunitense. ORISE è gestito da Oak Ridge Associated Università DOE contratto no. DE-AC05-06OR2310.
Vorremmo ringraziare il Dr. Kay Faaberg per i cloni infettivi HP-PRRSV, Dr. Susan Brockmeier per il suo aiuto con gli animali coinvolti nell’esperimento e Sue Ohlendorf per assistenza di segreteria in preparazione del manoscritto.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
References
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