Summary

Использование бактериальных патогенов чтобы зонд для сотовых и организмический уровне принимающей ответов

Published: February 22, 2019
doi:

Summary

Мы опишем, как анализы в vitro и in vivo инфекции, которые могут использоваться для анализа деятельности хост кодирования факторов.

Abstract

Существует целый ряд стратегий, которые используют бактериальных патогенов выжить и размножаться раз внутри эукариотической клетки. Так называемые «цитозольной» патогенов (Listeria monocytogenes, шигеллам Флекснера, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisи риккетсии spp.) получить доступ к зараженной клетки цитозоле физически и ферментативно унижающего достоинство первичной вакуолярной мембраны. Однажды в цитозоле, этих патогенов как размножаться, так и создания достаточной механических сил, чтобы проникнуть плазматической мембраны клетки-хозяина, чтобы инфицировать новые клетки. Здесь мы покажем, как этот терминал шаг цикла сотовой инфекции моноцитогенес л (Lm) может быть определена количественно, образуя колонии подразделение анализов и проточной цитометрии и привести примеры как оба возбудителя и хост кодировке факторов воздействия, это процесс. Мы также показывают, тесная связь Lm инфекции динамики культивируемых клеток, инфицированных в пробирке и тех клеток печени, производные от мышей инфицированных в естественных условиях. Эти функции на основе анализов относительно просты и могут быть легко масштабируются для обнаружения на основе экранов высокой пропускной способностью для модуляторы функции эукариотических клеток.

Introduction

Инфекции на основе экспериментальной модели изначально сложным вследствие их зависимости от начального состояния узла и возбудителя, различные стратегии возбудителя инфекции и трудности приписывая возбудителя и хост-процессов на основе результатов. Бактерией листерий (Lm) стал идеальным патогена на зонд узла обороны ответы из-за его генетических и микробиологических уступчивость, его стратегии быстрого и processive клеточных инфекции и относительно ясно связь между своей сотовой и организмический уровень инфекции фенотипов. Клеточных инфекции Lm проходит через четыре этапа1: (i) сотовых вторжения, которое заключает с Lm заключены в вакуоль; (ii) Lm-растворение мембраны вакуоль и выпуска Lm в цитозоль; (iii) intracytosolic репликации; и (iv) физического проникновения плазматической мембраны, что приводит либо инфекции непосредственно смежных ячеек (например, эпителиальные лист) или, в одиночных клетках, выпуск Lm в внеклеточной окружение. Каждый из этих этапов способствует конкретным Lm-кодировке факторов (упоминаемые как «факторы вирулентности»), при удалении, вызвать инфекции дефекты в клеточном и животных моделях. Эта стратегия общие инфекции независимо претерпела ряд так называемых «цитозольной» патогенов2.

Колония формирование подразделения (CFU) анализы широко используются для оценки как в лабораторных условиях (т.е., сотовой) также как в естественных условиях (т.е., гештальтпсихология) исходы инфекции. В дополнение к их высокая чувствительность, особенно для в-vivo инфекций CFU анализов обеспечивают недвусмысленный индикации возбудителя вторжение и внутриклеточных выживания/распространения. КОЕ анализы широко использовались для анализа Lm и принимающей ячейки определяющих влияние инфекции. Как информативным, как эти предыдущие исследования были анализировать сотовой вторжения и intracytosolic репликации, кое анализов не, в меру наших знаний, были использованы для отслеживания четвертый этап процесса инфекции Lm : сотовой побег. Здесь мы описываем относительно простые средства как сотовой побега (именуемый в дальнейшем «появление») могут контролироваться пробирного CFU (а также проточной цитометрии) и показать примеры как оба возбудителя и хост кодировке факторов регулировать этот этап лм цикл инфекции. Анализ терминала фазы клеточного цикла Lm инфекции может сделать возможным определить дополнительные возбудителя и принимающей ячейки инфекции специфические факторы и мероприятия.

Protocol

Мышей обращались гуманно в соответствии с все соответствующие правительственные руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных из национальных институтов здравоохранения и их использовании была утверждена для этого всего исследования Университета Майами инс…

Representative Results

Оценка роли возбудителя и хост кодировке факторов, влияющих на клеточном инфекцииИспользуя описанные выше условия инфекции, 0,15% от входного одичал типа Lm восстанавливается после 1,5 h совместно инкубации с искусственного макрофагов (рис. 1</str…

Discussion

Из-за его быстрого и processive клеточных инфекции программа Lm является идеальным возбудителя зонда клеточной деятельности, влияющих инфекции. Были определены ряд принимающих факторов, положительно или отрицательно влияют на Lm сотовой инфекции11,12<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

ACK Lysing Buffer Gibco  A1049201
ArC Amine Reactive Compensation Beads  Life Technologies A10346
BHI (Brain Heart Infusion) broth EMD Milipore 110493
Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Collagenase D Roche 11088858001
DMEM media  Gibco  11965-092
FACS tubes  BD Falcon 352054
FBS – Heat Inactivated  Sigma-Aldrich F4135-500ML
Hanks’ Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H6648-6X500ML
LB agar Grow Cells MS MBPE-4040
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit  Life Technologies L349S9
Rhodamine Phalloidin  Thermo Fischer R415
SP6800 Spectral Analyzer Sony
Syringe 28G 1/2" 1cc BD 329461
TPP Tissue Culture 48 Well Plates  MIDSCI TP92048
TPP Tissue Culture 6 Well Plates  MIDSCI TP92406
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42
Antigen
CD11b  Biolegend Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70
CD11c Biolegend Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418
CD45 Biolegend Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80 Biolegend Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8
Live/Dead Invitrogen Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100
Ly6C Biolegend Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4
MHC II Biolegend Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2
NK 1.1 Biolegend Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136

References

  1. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
  2. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
  3. Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
  4. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
  5. Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
  6. Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
  7. Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
  8. Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
  9. Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
  10. Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
  11. Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  12. Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
  13. Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
  14. Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
  15. Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
  16. Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
  17. Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
  18. VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).

Play Video

Cite This Article
Gayle, P., Freitag, N. E., Strbo, N., Schesser, K. Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (144), e58775, doi:10.3791/58775 (2019).

View Video