荧光显微镜对聚焦超声的刺激

Summary

低强度脉冲超声刺激 (lipus) 是一种非侵入性机械刺激的方式内源性或工程细胞具有较高的空间和时间分辨率。本文介绍了如何将 lipus 应用于荧光显微镜, 以及如何最大限度地减少超声路径上的声阻抗不匹配, 以防止不需要的机械文物。

Abstract

通过聚焦穿透软组织的低强度超声脉冲, lipus 代表了一种很有前途的生物医学技术, 可以远程和安全地操作神经发射、激素分泌和基因重新编程的细胞。然而, 由于缺乏生物物理机制, 目标组织能够感知和响应 lipus, 这一技术在医疗应用中的翻译工作目前受到阻碍。识别这些机制的一个适当方法是使用光学生物传感器与 lipus 相结合, 以确定潜在的信号通路。然而, 将 lipus 应用于荧光显微镜可能会引入不需要的机械人工制品, 因为存在反射、吸收和折射声波的物理界面。本文介绍了一个循序渐进的过程, 将 lipus 集成到商业上可用的直立荧光显微镜上, 同时最大限度地减少沿声学路径的物理界面的影响。描述了一个简单的程序来操作单元超声传感器, 并将传感器的焦点带入目标焦点。利用钙成像技术测量的人胶质母细胞瘤细胞中, 通过 lips 诱导的钙瞬变技术说明了 lipus 的应用。

Introduction

许多疾病需要某种形式的侵入性医疗干预。这些程序往往费用高昂, 风险大, 需要恢复期, 从而给保健系统增加负担。非侵入性治疗方式有可能为传统外科手术提供更安全、更便宜的替代品。然而, 目前的非侵入性方法, 如药物治疗或经颅磁刺激往往受到组织渗透、时空分辨率和不必要的非目标效应之间权衡的限制。在这方面, 聚焦超声是一种很有希望的非侵入性技术, 有可能操纵组织内部深处的生物功能, 具有较高的时空准确性和有限的非目标效应。

聚焦超声刺激包括在生物体深处的精确位置提供声学能量。根据声学脉冲参数, 这种能量可以有多种医学用途。例如, 食品药品监督管理局已批准使用高强度聚焦超声 (hifu) 对前列腺肿瘤、引起震颤的大脑区域、子宫肌瘤和导致疼痛的神经端进行热消融¹.hif 介导的微泡空化也被用来短暂地打开血脑屏障, 以便有针对性地提供系统管理的治疗方法²。用于 hfu 应用的空间峰值脉冲平均强度 (i_sppa) 和空间峰值时间平均强度 (i_spta) 通常在几个 kw cm-2 以上, 并产生几十兆帕的脉冲压力。这些强度值远远高于 fda 批准的 i_sppa和 i_sppa限制的诊断超声, 190 w 厘米-2和 720 mw 厘米-², 分别<....

Protocol

1. 透明透明聚酯薄膜上的生长细胞

1. 使用垂直压钻在标准35毫米培养盘底部钻12毫米孔大小。慢慢移动钻头, 并戴上护目镜。使用刀片取出连接在盘子底部的塑料碎片, 在侧面形成光滑的表面 (图 2)。
2. 在菜品的外底面涂上一层薄薄的海洋级环氧树脂或胶水。
3. 将聚酯薄膜 (2.5 微米厚) 放在盘子的外底面上, 并用力按压, 以确保环氧胶在薄膜和厚塑料表面之间均匀地扩散。用手指以离心方式轻轻拉膜, 形成平坦的表面 (图 2)。
4. 当环氧胶干燥后, 用95% 乙醇对聚酯底部的盘子进行短暂的漂洗, 并将盘子和盖子的内表面置于强 254 nm uv 激发源下进行消毒。调整持续时间和强度, 提供约 330 mj 厘米^-2的紫外线剂量, 以完全销毁大多数类型的微生物。使用 1, 000μw cm-2 uv 照明, 这种能量大约相当于 5分钟的持续时间。
5. 在小管 (50-100μl) 中提供的细胞外基质蛋白混合物 (empm), 并在无菌条件下将其存储在-20°c 或更低的温度下。
6. 在无菌环境中 (例如,在生物安全柜内), 用所需的培养基稀释冷冻的 empm 库存, 使其达到1:100。在冰上工作, 防止在室温下进行 empm 聚合。快速将100μl 的中混合....

Results

图 5是使用钙成像多路复用的 lipus 实验的一个例子。在标准培养基中 (辅以10% 血清和1% 抗生素) 的 empm 涂层聚酯薄膜上培养胶质母细胞瘤细胞 (a-172), 并以钙敏感荧光记者氟-4 am 孵育。使用10倍浸入透镜对细胞进行成像, 并使用白色 led 光源进行照明, 并使用标准 gfp 滤光片集收集荧光灯。lipus 是通过手动驱动脉冲波形为 158 v 峰值振幅、0.1 ms 脉冲持续时间和 10 ms 脉冲重复频率 (即1% 占空比) 的 4 mhz 传感器来应用的。这些参数分别对应于 i_sppa = 88 w cm-2 (远低于 190 w cm-2^的诊断限制)^{和 i}_sppa = 877 mw cm-2 (略高于 720 mw cm-2 的诊断限制).结果表明, 这种刺激产生了强大的钙升高(

Discussion

聚焦超声的一个主要优点是能够以高时空精度向生物样品非侵入性地传递机械和热能或热能。其他旨在机械刺激细胞的技术通常采用侵入性物理探针 (如细胞戳), 或需要高能激光束与异物 (如光推子) 相互作用。磁加热可以加热生物样品中的特定空间位置, 但需要存在外来磁性纳米粒子。另一方面, 使用红外或微波激发17、^18、19可以在水介质中精确地无侵入性加热小样本 (例如细胞培养^物)。

由于没有能够与荧光显微镜结合进行超声激发的商业系统, 许多生物物理学家创建了定制系统, 以适应其特定的应用 8^{,12 ,13,20}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
大工作容积的正置显微镜	Thorlabs	CERNA
大工作容积的正置显微镜	Scientifica	SliceScope
光机械组件	Thorlabs	n/a
针式水听器	ONDA Corporation	HNP/C/R/A/T 系列 + AH/G 前置放大器
针式水听器	精密声学	不适用
光纤水听器	ONDA Corporation	HFO 系列
光纤水听器	精密声学	不适用
示波器	Keysight Technology	DSOX2004A（4 通道 70MHz）
函数发生器	Keysight Technology	33500B（20MHz 单通道）
射频功率放大器	Electronic Navigation Industries （ENI）	325LA， 525LA， 240L， 350L， A075， 2100L， 3100LA
射频功率放大器	电子 &创新 （E&I）
浸入式超声换能器	奥林巴斯	聚焦浸入式超声探头
浸入式超声换能器	底托波仪器	HiFu 换能器 BII-76 系列
浸入式超声换能器	精密声学	压电陶瓷或 HiFu 换能器
浸入式超声换能器	Ultrasonic-S-lab	HiFu 传感器按订单
高密度 Matrigel	Corning	VWR 80094-330
聚酯薄膜 2.5 微米	Chemplex	CAT.NO:107