Summary

Rat placental doğal katil hücre Cytolytic fonksiyon değerlendirilmesi için bir plaka tabanlı sitotoksisite assay

Published: June 02, 2019
doi:

Summary

Burada, doğal katil hücrelerin sitotoksisik fonksiyonunu renkmetrik plaka tahlili ile plasenta satıyor ‘dan izole etmek ve değerlendirmek için ayrıntılı bir metodoloji sağlıyoruz. Plasental iskemi azaltılmış uterus perfüzyon basınç sıçan modeli antikor aracılı yalıtım ve doğal katil hücrelerin sitotokleş fonksiyonunun değerlendirilmesi göstermek için seçildi.

Abstract

Bu desidual doğal katil (NK) hücrelerin kurulması ve normal gebelik bakım kritik bir rol oynarlar bilinmektedir. Son çalışmalar, tekrarlayan düşük ve preeklampsi gibi olumsuz gebelik komplikasyonlarından muzdarip kadınlarda dolaşan ve desidual NK hücrelerinin değiştirilmiş bir nüfusunu göstermiştir. Grubumuzun çalışmaları, gebelikte hipertansiyon, yüzey aktivasyon işaretçileri ifadesine dayalı plasenta aktif NK hücrelerinin artan bir nüfus ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu makalede, cerrahi olarak indüklenen plasental iskemi preeklampsi benzeri bir hayvan modelinde plasenta satıyor izole NK hücrelerinin sitotokezik fonksiyonunu değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Aşağıdaki adımlar ayrıntılı olarak açıklanmıştır: tek hücreli süspansiyon üretimi, NK hücre yalıtımı, ex vivo stimülasyon, effector: hedef hücre Co-Culture, ve sitotoksisite tahlil.

Introduction

Preeklampsi fetal büyüme kısıtlaması, son organ hasarı ve kronik bağışıklık aktivasyonu ile karakterize gebelik hipertansif bir hastalıktır. Preeklampsi olan kadınlarda kronik bağışıklık aktivasyonu artan dolaşım ve plasental inflamatuar sitokinlerin yol açar, CD4+ T hücreleri nüfus bir dengesizlik, ve aktif doğal katıl (NK) hücrelerin artan bir nüfus1. Laboratuvarımız tarafından son yayınlanan çalışmalar, preeklampsi azaltılmış uterin perfüzyon basıncı (RUPP) sıçan modelinde preeklampsi ile ilişkili bazı Patofizyoloji neden olan NK hücreleri için bir rol gösteriyor. NK hücrelerinde harekete geçirmek işaretçilerinin yüzey ifadesini ölçmek için Akış sitometrisi kullanarak, normal hamile (NP) farelerine kıyasla Rupp farelerinin dolaşım ve plasenta satıyor aktif NK hücrelerinin artan bir nüfus görüldü2.

Akış sitometri gözlemlerini onaylamak için, NP ve Rupp fareler plasenta satıyor izole NK hücrelerinin sitotokezik aktivitesini değerlendirmek için fonksiyonel çalışmalar yapıldı. Sitotoksisik CD8+ T HÜCRELERININ ve NK hücrelerinin sitotokezik fonksiyonunun değerlendirilmesi için çeşitli yöntemler mevcuttur. Fonksiyonel sitotoksisik analiz için altın standardı krom salınım tahlil3. Kullanılan diğer gelişmiş protokoller arasında akış sitometri4, görüntü sitometri5, calcein sürüm6ve en son biyolüminesans7yer aldı. Bu video, ticari olarak kullanılabilen bir LDH sitotoksisite assay kiti kullanılarak NK hücrelerinin sitotoksisik fonksiyonunu ölçmek için iyi kurulan lakdamak dehidrojenaz (LDH) serbest bırakma tahlil kullanarak ayrıntılı bir protokol sağlayacaktır.

Protocol

Tüm protokoller Mississippi Tıp Merkezi Üniversitesi ‘nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanların bakımı ve kullanımı, etik Hayvansal tedavi için Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallarına uygun idi. 1. Placentas ‘tan lenfosit hücre yalıtımı Bir plasenta fare uterusundan (gebelik günü 19) çıkarın ve 10 mL buz soğuk PBS8’ de yerleştirin. Bir 100 μm filtre üzerine bir plasenta yerle?…

Representative Results

NP ve RUPP farelerinden elde edilen placental NK hücreler, 50:1 (NK: Target) oranındaki hedef hücreler ile ilgili Medias ‘da 5 h için inkübe edildi. Emici 490 nm ‘de kaydedildi ve ham veriler Tablo 2′ de gösterilir. Kültür orta arka plan ve hacim düzeltme kontrol kuyuları ortalama absorbans hesaplanmıştır. Bu ortalamalar, üreticinin protokolünde belirtilen uygun kuyulardan çıkarılır ve Tablo 3’ te temsil edilir. Düzeltilmiş değerler daha sonra üretici tarafından s…

Discussion

En iyi sonuçlar için dikkate alınması gereken önemli notlar bir dizi vardır. Kullanılan hücrelerin sterilitesi çok önemlidir. Plasentanın toplanması sonrasında, NK hücrelerinin hazırlanması ve yalıtımının Biyogüvenlik kabininde steril koşullarda gerçekleştirilmesi önemlidir. Ayrıca, hücresel hasar üzerine tüm hücreler LDH serbest olduğundan, yalıtım sonra ve Co-Culture sürecinde NK hücrelerinin yüksek bir canlılığı elde etmek için bakım alınmalıdır. NK hücrelerinden çok fazl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Ulusal kalp akciğer ve kan Enstitüsü Sağlık Ulusal Enstitüleri tarafından Grant R00HL130456, Ulusal Sağlık Enstitüsü Genel Tıp Bilimleri Ulusal sağlığı Enstitüleri tarafından ödül P20GM104357 altında, ve tarafından desteklenmektedir Mississippi ıNBRE, bir kurumsal Kalkınma Ödülü tarafından finanse (fikir) genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü Sağlık Ulusal Enstitüleri hibe numarası P20GM103476 altında. İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez.

Materials

1.5 mL Eppendorf tube Fisher 5408129
100 µL Filter Fisher 22363549 Nylon Mesh
15 mL conical tube Fisher 0553859A
3 mL syringe Fisher 14823436
50 mL conical tube Fisher 7203510
6-well cell culture plate Corning 720083
96-well Tissue Culture Plate CELLTREAT 229190 Sterile, Round Bottom
AOPI Nexcelom CS201065ML
Cell scraper Fisher 8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer Nexcelom N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit Promega G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit Invitrogen 11061D
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D
EDTA Sigma Aldrich EDS-100G
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Flow Cytometry Tube Corning 352008
Lymphoprep Fisher NC0460539 Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS Fisher SH3025801 10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Petri dishes Fisher 9720500 Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a BD Biosciences 555006
Purified Mouse anti-Rat CD3 BD Biosciences 554829
Recombinant Rat IL-2 R&D Systems 502-RL
RPMI Gibco 11875135 1640 Medium
T25 flask Corning 430639
Trypsin ThermoFisher 15090046
YAC-1 cell ATCC TIB-160

References

  1. Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
  2. Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
  3. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  4. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  5. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
  6. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  7. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
  8. Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
  9. Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
  10. Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).

Play Video

Cite This Article
Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).

View Video