Técnicas analíticas de alta resolución complementarias solo rendimiento para caracterizar mezclas complejas de materia orgánica Natural
Summary
Este protocolo describe un rendimiento único para técnicas complementarias analíticas y ómicas que culmina en una caracterización totalmente emparejado de materia orgánica natural y proteómica microbiana en diferentes ecosistemas. Este enfoque permite comparaciones robustas para la identificación de rutas metabólicas y transformaciones importantes para describir la producción de gas de efecto invernadero y predecir las respuestas al cambio ambiental.
Abstract
Materia orgánica natural (NOM) se compone de una mezcla muy compleja de miles de compuestos orgánicos que, históricamente, resultó difíciles de caracterizar. Sin embargo, para entender los controles de termodinámicos y cinéticos de producción de gas (dióxido de carbono [CO2] y metano [CH4]) de efecto invernadero resultantes de la descomposición de la NOM, una caracterización del nivel molecular junto con microbiana Análisis del proteoma es necesario. Además, clima y cambios ambientales se espera que perturban los ecosistemas naturales, trastornar potencialmente complejas interacciones que influyen en el suministro de sustratos de materia orgánica y los microorganismos realizar las transformaciones. Una detallada caracterización molecular de la materia orgánica, microbios proteómica, vías y transformaciones por la que se descompone la materia orgánica será necesaria predecir la dirección y magnitud de los efectos de los cambios ambientales. Este artículo describe una capacidad metodológica para la caracterización de metabolitos completa en una sola muestra por inyección directa de Fourier transform ion ciclotrón resonancia espectrometría de masas (FTICR-MS), cromatografía de gases espectrometría de masas (GC-MS), Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), espectrometría de masas cromatografía líquida (LC-MS) y el análisis de proteómica. Este enfoque genera un conjunto de datos totalmente emparejado que mejora la confianza estadística para inferir rutas de descomposición de materia orgánica, la resultante de CO2 y tasas de producción de CH4 y sus respuestas a las perturbaciones ambientales. En este documento presentamos los resultados de aplicar este método a la NOM las muestras recogidas de las turberas; sin embargo, el protocolo es aplicable a cualquier muestra NOM (por ejemplo, turba, suelos forestales, sedimentos marinos, etc.).
Introduction
A nivel mundial, los humedales se estiman contienen 529 Pg de carbono (C), sobre todo como C orgánico enterrado en turba depósitos1. Actualmente, tales las turberas actúan como sumidero neto de C, secuestrar 29 Tg C y-1 en América del norte sólo1. Sin embargo, perturbaciones ambientales tales como drenaje, incendios, sequías y temperaturas más cálidas pueden compensar este fregadero C aumentando la descomposición de materia orgánica, resultando en mayor C las pérdidas por gases de efecto invernadero (dióxido de carbono [CO2] y producción de metano [CH4]) de1,2. Cambio climático puede contribuir a la pérdida de C si temperaturas o condiciones secador estimulan más rápido C descomposición por microorganismos. Por otra parte, temperaturas más altas y concentraciones de CO2 del aire pueden estimular la producción primaria para secuestrar más de CO2 como carbono orgánico (OC). En qué medida y qué tan rápido que OC se descompone luego en CO2 y CH4 depende de las complejas interacciones entre los substratos donantes de electrones, la disponibilidad de aceptores de electrones y los microorganismos que median la transformación. En muchos casos, los mecanismos no están bien caracterizados, así su respuesta a las perturbaciones ambientales no es bien limitada y no está claro cuál será el resultado del cambio climático en el balance de carbono en ecosistemas de turberas.
La compleja naturaleza de la materia orgánica natural (NOM) ha hecho incluso identificar los compuestos orgánicos presentes en las mezclas NOM históricamente difíciles. Recientes avances han mejorado nuestra capacidad de caracterizar compuestos que tradicionalmente y, en cierta medida, considerarse como recalcitrante húmicos o fúlvicos compuestos3,4,5. Ahora entendemos que muchos de estos compuestos son realmente microbios disponibles y pueden ser descompuestos si un aceptor de electrones terminal adecuado (TEA) es hecho disponible6,7. Calcular el estado de oxidación nominal del carbono (NOSC) de un compuesto proporciona una métrica para predecir el potencial de descomposición y la producción de energía del té requerida. Sin embargo, requiere una caracterización del nivel molecular de la materia orgánica7. NOSC se calcula de la fórmula molecular mediante la siguiente ecuación7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, donde z es la carga neta. NOSC está relacionada con la termodinámica conducción fuerza8, en donde son más fáciles de degradar, mientras que compuestos con menor NOSC requieren infusiones cada vez más enérgicos para reducir compuestos con mayor NOSC. Compuestos con menor que −2 NOSC requieren una energía alto rendimiento tés como O2, nitrato o MnIVy no pueden ser degradados por que ocurren comúnmente bajar energía produciendo tés como el FeIII o sulfato7. Esta es una consideración importante en las condiciones anóxicas empapadas en humedales donde O2 y otros alta energía produciendo tés son escasos9 y por lo tanto la degradación de compuestos NOSC inferiores en estas condiciones termodinámico limitada. Perturbación ambiental puede influir en el estado termodinámico del ecosistema a través de cambios hidrológicos que influyen O2 (el más energético aceptador del electrón), cambios en los sustratos orgánicos y aceptadores del electrón disponibles por primario producción y en menor medida por la temperatura. Un ejemplo importante de los efectos de temperatura en sistemas de humedales se produce con respecto a la compensación que se produce entre homoacetogenesis (es decir, la producción de acetato de CO2 y H2) y (metanogénesis) hydrogenotrophic es decir, producción de CH4 CO2 y H2). A bajas temperaturas parece que homoacetogenesis es un poco favorecido, mientras que las temperaturas más cálidas favorecen CH4 producción10. Este efecto de la temperatura puede tener implicaciones importantes para la respuesta de los ecosistemas al cambio climático, como el CH4 es un gas invernadero mucho más fuerte que el CO211 y así aumentar la producción de CH4 a expensas de CO2 en las temperaturas más cálidas pueden contribuir a una regeneración positiva con el calentamiento climático.
Las turberas producen a nivel mundial grandes cantidades de CO2 y CH46a través de la respiración microbiana de origen natural orgánico materia. NOSC de los substratos de carbono orgánico determina la proporción relativa de CO2: CH4 producido que es un parámetro crítico debido a la mayor forzamiento radiativo de CH4 en comparación con CO211, sino también porque esfuerzos de modelado han identificado esta relación como un parámetro crítico para estimar el flujo de C en las turberas12. En la ausencia de aceptadores del electrón terminal diferente a CO2, puede ser demostrado por el equilibrio de electrones que los sustratos orgánicos de C con la voluntad de > 0 NOSC producen CO2: CH4 > 1, C orgánico con NOSC = 0 produce CO2 y CH4 en relación equimolar y el C orgánico con NOSC < 1 producen CO2: CH4 < 113. Descomposición de OC en los ecosistemas naturales está mediatizada por microorganismos, por lo que aun cuando la degradación de un compuesto específico es termodinámicamente factible, es cinéticamente limitado por la actividad de enzimas microbianas y, bajo condiciones anóxicas, por el fuerza impulsora termodinámica (es decir, NOSC)7. Hasta ahora ha sido difícil para caracterizar completamente la materia orgánica debido a la diversidad de compuestos presentes requiere diferentes técnicas complementarias para su caracterización. Los avances recientes han cerrado la brecha; con una serie de técnicas analíticas podemos analizar una amplia gama de compuestos orgánicos proporcionando caracterización nivel molecular y, en la cuantificación de algunos casos, de pequeños metabolitos primarios como glucosa hasta 800 Da poli-heterociclos. Previamente tales moléculas complejas grandes habría caracterizadas simplemente como lignina-como o como tanino y asumido para haber sido recalcitrantes. Caracterización del nivel molecular, sin embargo, permite el cálculo de NOSC para estas grandes moléculas complejas. Estos valores NOSC se correlacionan linealmente con la fuerza impulsora termodinámica que permite una evaluación de la calidad de la materia orgánica disponible para la descomposición, que en muchos casos revela que estas moléculas complejas pueden ser microbios degradable incluso bajo las condiciones anóxicas que prevalecen en los humedales.
Introducción de O2 permite la materia orgánica de casi todos los valores NOSC naturalmente observadas a descomponer, en este documento nos centramos en cambios en la materia orgánica y microbiana proteómica que es probable ser los conductores primarios en humedales (es decir, sistemas LIMITADA O2). Sin embargo, todas las técnicas que vamos a discutir pueden aplicarse a materia orgánica de cualquier ecosistema. Comúnmente, mediciones masivas basan en óptica y análisis de la fluorescencia se han utilizado para evaluar la calidad de materia orgánica3,14. Cuando se utiliza a granel medidas como éstas, sin embargo, detalles finos se pierden como grandes números de moléculas se clasifican juntos bajo términos genéricos como substancias húmicas o fulvics. Las definiciones de estas categorías no son bien limitadas y, de hecho, pueden variar las comparaciones de un estudio a otro haciendo imposible. Además, mediciones masivas no proporcionan el detalle molecular necesario para el cálculo de la termodinámica que rigen el sistema y por lo tanto, distando realmente evaluar la calidad de materia orgánica15.
Técnicas individuales tales como Fourier transforman ciclotrón resonancia spectrometry total de ion (FTICR-EM), espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), cromatografía de gases masa espectrometría total (GC-MS) y espectrometría de masas cromatografía líquida (LC-MS) hacer proporcionar tales detalles a nivel molecular. Mientras que cada una de estas técnicas presenta sus propias limitaciones, que también traen sus propias fortalezas que pueden aprovecharse en un enfoque integrado para lograr el fino detalle molecular necesario para cuantificar la calidad de la materia orgánica en un sentido termodinámico riguroso . GC-MS es útil para identificar metabolitos pequeños críticos que puedan tener influencia proximal en CO2 y CH4 producción (p. ej., glucosa, acetato, etc.); sin embargo, GC-MS requiere verificación contra un estándar y por lo tanto se limita a compuestos ya conocidos presentes en la base de datos prevención de identificación de nuevos compuestos. Además, GC-MS es una técnica semi-cualitativa que permite la inferencia sobre los cambios en concentraciones relativas, pero no proporciona la información real de la concentración necesaria para el cálculo de las energías libres de Gibb por ejemplo. Por último, GC-MS requiere derivatización de moléculas antes del análisis, que limita la resolución a compuestos más pequeños que Da ~ 400 y alcoholes volátiles se pierden durante la etapa de secado.
Unidimensional (1D) 1H NMR de estado líquido permite altamente cuantitativa caracterización de metabolitos pequeños (incluyendo metabolitos primarios pequeño peso molecular y volátiles como alcoholes, acetato, acetona, formiato, piruvato, succinato, ácidos grasos de cadena corta, así como una variedad de carbohidratos notoriamente ausentes o comprometidas de métodos basados en MS) y sus concentraciones son particularmente útiles para el cálculo de parámetros termodinámicos. Sin embargo, como GC-MS, 1D NMR de mezclas complejas requiere estandarización con respecto a una base de datos y por lo tanto no solo permite fácil identificación de nuevos compuestos que pueden ser abundantes en los ecosistemas naturales y cambiantes complejo. Además, NMR es menos sensible que las técnicas basadas en MS y por lo tanto, metabolito cuantitativo de perfiles se logra sólo por encima de 1 μm utilizando NMR sistemas equipados con sondas de frío refrigerado por helio. No muy apreciado, algunas sondas de frío NMR son tolerantes a la sal y permiten análisis ambiental de la mezcla en presencia de concentraciones de sal milimolar en menor diámetro (< 3 mm de diámetro exterior) muestra tubos16. Sin embargo, otra complicación de la RMN es que altas cantidades de metales paramagnéticos y minerales (p. ej., Fe y Mn por encima de 1-3% en), que puede ser abundante en suelos de secano, puede ampliar características espectrales y complicar la interpretación de los espectros de RMN . Usando extracción en fase sólida (SPE) pueden ayudar en la interpretación de la RMN y MS base metabolómica métodos de reducción de las sales minerales y aumentando la calidad espectral.
FTICR MS por inyección directa es una técnica muy sensible capaz de detectar miles de metabolitos de una sola muestra, pero no captura los metabolitos pequeños críticos como acetato, piruvato, succinato y es muy difícil de uso de azúcares y otros hidratos de carbono17, ni aporta información cuantitativa. Sin embargo, a diferencia de las otras técnicas, FTICR-MS se destaca en la identificación y asignación de fórmula molecular a compuestos novedosos y por lo tanto identifica el mayor número de compuestos moleculares más información que cualquiera de las otras técnicas descritas. Esto es útil, porque las informaciones moleculares FTICR-MS (y otras técnicas) se pueden utilizar para calcular NOSC que se relaciona con la fuerza impulsora termodinámica que gobiernan la probabilidad de que sus tarifas bajo ciertas y determinadas reacciones8 condiciones7. Además, por acoplamiento FTICR-MS con técnicas de separación, como LC junto con tandem MS, información estructural cuantitativa se puede lograr, compensando algunas de las desventajas de esta técnica. LC-MS es útil para identificar compuestos lípido-como y otros metabolitos que no están bien caracterizadas por cualquiera de los otros métodos. Acoplador LC FTICR-MS o LC-MS con un colector de fracciones y recoger fracciones de incógnitas específicas de interés para la elucidación estructural por el estado líquido de dos dimensiones (2D) NMR es la situación ideal para la identificación y cuantificación de compuestos desconocidos18 ,19. Sin embargo, este es un paso muy desperdiciador de tiempo que podría utilizarse si es necesario. Tomados individualmente, cada una de estas técnicas proporcionan una instantánea diferente de la materia orgánica, y por integrar a los mismos, podemos lograr una comprensión más completa que cualquiera de las técnicas de aislamiento.
Mientras que las consideraciones termodinámicas las restricciones ultimate qué transformaciones son posibles en un sistema, descomposición de materia orgánica es mediada por microorganismos cuya actividad enzimática controla las tasas de reacción. Por lo tanto, comprender plenamente los controles en la descomposición de materia orgánica y producción de gas (CO2 y CH4) de efecto invernadero de los humedales requiere un enfoque integrado ómicas para caracterizar la actividad enzimática microbiana así como los metabolitos. En este artículo, se describe un método para lograr un completo análisis de una muestra mediante un enfoque secuencial que se traduce en un análisis totalmente sincronizado. Este enfoque amplía el metabolito, la proteína y el protocolo de extracción (MPLex) de lípidos en la cual proteómica fue juntado con GC-MS y LC-MS20 para identificar pequeños metabolitos, proteínas y lípidos mediante la incorporación de información metabolito cuantitativo a través de RMN e identificación de los mayores metabolitos secundarios vía FTICR-Sra. ligeramente diferente a MPLex, iniciamos el protocolo con una extracción de agua y luego uso extracción sucesiva con solventes no polares cada vez más. Todas las extracciones se realizan en una sola muestra que conserva la muestra cuando los volúmenes son limitados o difíciles de conseguir y disminuye el error experimental introducido a través de la variación entre alícuotas de matrices de muestras heterogéneas (p. ej., el suelo y la turba) o diferencias en las condiciones de almacenamiento y duración.
Por último, por los análisis de OM con análisis de Proteómica de la comunidad microbiana de acoplamiento, podemos construir redes metabólicas que describen los caminos y la transformación de la descomposición de materia orgánica. Esto nos permite poner a prueba hipótesis específicas acerca de cómo influirá en las perturbaciones al sistema ultimate CO2 y CH4 producción mediante la alteración de los sustratos orgánicos disponibles, aceptadores del electrón y las comunidades microbianas mediar las reacciones a través de la actividad de enzima catalizadores.
El objetivo general de este método es proporcionar un protocolo de rendimiento individual para el análisis de metabolitos, lípidos y proteínas microbianas de una sola muestra, creando un conjunto de datos totalmente emparejado para la construcción de redes metabólicas y restricción de errores analíticos .
Protocol
Representative Results
Discussion
El solo rendimiento, corriente de análisis completamente acoplado usado para caracterizar los metabolitos y el proteoma proporciona penetraciones en los caminos por que C ciclismo ocurre en un ecosistema complejo. Suelo y la turba son matrices heterogéneas, y por lo tanto, uno de los pasos críticos de este método se produce en los primeros pasos para asegurar que la partida de la turba o material del suelo es muy homogéneo. Es preferible triturar como agregados pueden reducir la eficiencia de la extracción. Se trat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Chanton J.P., J.E. Kostka y M.M. Kolton por asistencia para recoger muestras de turba. Porciones de este trabajo se realizaron en el laboratorio ambiental de Ciencias moleculares, una DOE de ciencia usuario oficina patrocinada por la oficina de biológico y ambiental. PNNL es operado por Battelle para la coneja bajo contrato DE-AC05-76RL01830. Este trabajo fue financiado por el Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia e investigación oficina de biológico y ambiental (otorga: DE-AC05-00OR22725, DE SC0004632, DESC0010580, DE SC0012088 y DE SC0014416).
Materials
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
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