Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes
Summary
Le protocole actuel décrit une méthode intégrée sur le cancer cell migration et invasion sur une seule plateforme en temps réel, offrant une option facilement reproductible et plus économes en temps d’étudier la morphologie et la mobilité de la cellule.
Abstract
Cancer cellule mobilité est cruciale pour l’ouverture de la métastase. Enquête du mouvement cellulaire et la capacité invasive est donc d’une grande importance. Les essais de migration donnent une idée de base du mouvement cellulaire au niveau 2D, tandis que les analyses d’invasion sont plus physiologiquement pertinents, imitant le détachement cellulaire in vivo cancer du site original et envahir par l’intermédiaire de la matrice extracellulaire. Le protocole actuel prévoit un seul flux de travail pour les essais de migration et invasion. Avec la caméra intégrée de microscopique automatisée pour les images HD en temps réel et le module d’analyse intégré, il donne des chercheurs un temps-efficace, simple et reproductible option expérimentale. Ce protocole comprend également des substitutions pour les consommables et les méthodes d’analyse des choix pour les utilisateurs à choisir.
Introduction
La migration cellulaire et l’invasion sont des processus biologiques importants qui permettent les fonctions normales du corps humain, comme la fermeture de la plaie, invasion du placenta dans l’utérus et glandes mammaires morphogenèse1,2,3. Le corps humain a un contrôle rigoureux et précis de ces événements biologiques ; Cependant, il y a quelques exceptions près. Les tumeurs malignes, par exemple, sont en mesure d’échapper à cette sauvegarde, pièce prolifération anormale et envahir dans les tissus voisins, qu’on appelle des métastases. Métastase est la principale cause de mortalité liée au cancer4.
Le cancer du sein est le plus couramment diagnostiqué le cancer chez les femmes et est la deuxième cause de décès liés au cancer chez les femmes dans les pays développés dans le monde entier5. Le cancer provient de conduits ou lobules qui consistent en une ou plusieurs couches de cellules épithéliales. Dans le sein normal, les cellules épithéliales sont rattachés les uns et à la membrane de sous-sol par l’intermédiaire de protéines membranaires telles que E-cadhérine et les intégrines6. Cependant, les cellules du cancer du sein invasif ont perdu leur polarité et l’adhérence de cellules et classiquement subissent une transition mésenchymateuse épithéliale (EMT) et acquièrent la capacité de se déplacer. Après extravasation, ces cellules se déplacent sur la matrice extracellulaire (ECM) et entrer dans le vaisseau sanguin ou le système lymphatique, suivie ensuite d’intravasation et croissance métastatique7. La compréhension des mécanismes par lesquels ceci se produit est d’une grande importance, puisque les métastases est la cause la plus fréquente de mortalité liée au cancer et est étroitement lié au cancer cell migration/invasion. Afin de visualiser le mouvement des cellules cancéreuses, les essais de migration et invasion sont les modèles idéales pour étudier le mouvement cellulaire 2D et 3D, respectivement. Migration évalue directement le mouvement des cellules tandis qu’invasion implique une interaction avec le microenvironnement et la capacité à dégrader les barrières biologiques. Les deux processus ne sont pas totalement indépendants d’un de l’autre, que la migration est une exigence d’invasion.
Plusieurs méthodes ont été développées pour étudier les migrations et l’invasion. Tel que revu par Kramer et al., des tests de migration comme la cicatrisation, clôture et analyses micro-transporteur génèrent une zone acellulaire pour permettre les cellules habitable, à évaluer le changement de zone ; considérant que, essais transwell et capillaire sont basés sur le nombre de cellules qui se déplacent vers un attractant8. Pour les analyses d’invasion, un environnement ECM doit être mis en place avec du gel de l’ECM ou collagène par exemple, et le mouvement 3D peut être évaluée en surveillant les comtes invasion de zone, de distance et de cellule (p. ex. transwell dosage, dosage de l’ornithorynque)8. Un autre type de test de l’invasion est de combiner les cellules invasives avec les cellules non invasif et évaluer le comportement des cellules envahissantes (p. ex. sphéroïde dosages). Les méthodes ci-dessus ont leurs avantages et inconvénients et une manière facile d’approche, facile à répéter et à combiner le test de migration et invasion dans un flux de travail similaire est préférentiel dans une conception expérimentale.
Ce protocole décrit la mesure de la migration cellulaire et l’invasion à l’aide d’un imageur de cellules vivantes. C’est une cellule en temps réel système installé dans un incubateur de culture cellulaire standard de surveillance. Il prend des images haute définition avec le jeu de numérisation des intervalles et des mesures en appliquant des masques appropriés pour les cellules ou les cibles fluorescents. Le module de test de migration/invasion inclut à l’aide d’un outil de grattage 96 broches, qui est adapté pour la fabrication des plaies gratter homogènes sur une monocouche de cellules dans une plaque à 96 puits. Le mécanisme est basé sur une plaie in vitro tests de guérison, de surveillance des mouvements de cellules 2D sur un plastique ou revêtement. Invasion ou mouvement 3D à travers un ECM supplémentaire dans le scratch enroulé également peut être évaluée. Un flux de travail bref est illustrée à la Figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migration et invasion sont des paramètres importants pour évaluer la mobilité des cellules cancéreuses. En utilisant l’outil de grattage 96 broches, il est possible de procéder à la guérison des dosages en 2D et 3D en même temps. En dehors de faciliter la numérisation automatique, offrant un milieu de culture des variétés de cellule stables avec le minimum de perturbations, la gratter essai effectué à l’aide de l’outil de grattage 96 broches fournit des plaies gratter cohérentes, permettant des expér…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à souligner notre soutien financier de la fondation du groupe Bloomfield à travers le Hunter Medical Research Institute (HMRI 13-02). X.Z est soutenu par une bourse d’études de l’APA par le biais de l’Université de Newcastle et la bourse de doctorat HCRA biomarqueurs phare.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
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- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
