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Genetics

संक्रमित ऊतकों में बैक्टीरियल जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति आधारित विधि

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/59055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Georgetown University

Summary

यहां वर्णित एक सेलुलर स्तर पर पशु ऊतकों में बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए एक विधि है । इस विधि एक संक्रमण के दौरान ऊतक पर्यावरण के जवाब में एक जीवाणु आबादी के भीतर होने वाली phenotypic विविधता का अध्ययन करने के लिए एक संसाधन प्रदान करता है ।

Abstract

बैक्टीरियल डाह जीन अक्सर कई कारकों है कि विभिंन पर्यावरणीय संकेतों का जवाब द्वारा transcriptional स्तर पर विनियमित रहे हैं । कुछ कारकों डाह जीन पर सीधे कार्य; दूसरों के बहाव नियामकों या संकेतों के संचय कि नियामक गतिविधि को प्रभावित की अभिव्यक्ति का समायोजन करके रोगजनन नियंत्रण । जबकि विनियमन बड़े पैमाने पर इन विट्रो विकास के दौरान अध्ययन किया गया है, अपेक्षाकृत कम कैसे जीन अभिव्यक्ति संक्रमण के दौरान समायोजित है के बारे में जाना जाता है । इस तरह की जानकारी महत्वपूर्ण है जब एक विशेष जीन उत्पाद चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक उंमीदवार है । मात्रात्मक, वास्तविक समय आरटी-पीसीआर और आरएनए-Seq तरह Transcriptional दृष्टिकोण एक वैश्विक स्तर पर जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए शक्तिशाली तरीके हैं, लेकिन मेजबान आरएनए की तुलना में बैक्टीरियल आरएनए की कम बहुतायत सहित कई तकनीकी चुनौतियों से पीड़ित हैं, और नमूना RNases द्वारा ह्रास । विनियमन का मूल्यांकन फ्लोरोसेंट पत्रकारों का उपयोग अपेक्षाकृत आसान है और अद्वितीय वर्णक्रमीय गुणों के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है । विधि एकल कोशिका के लिए अनुमति देता है, ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति की spatiotemporal विश्लेषण है कि जटिल तीन आयामी वास्तुकला और physiochemical ढाल है कि बैक्टीरियल विनियामक नेटवर्क को प्रभावित प्रदर्शन । ऐसी जानकारी खो जाती है जब डेटा का औसत थोक जनसंख्या से अधिक हो । साथ ही, हम सीटू मेंजीवाणु रोगजनकों में जीन अभिव्यक्ति को बढ़ाता है के लिए एक विधि का वर्णन । विधि सरल ऊतक प्रसंस्करण और रिपोर्टर प्रोटीन से प्रतिदीप्ति के प्रत्यक्ष अवलोकन पर आधारित है । हम Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), जिसकी जीन उत्पाद प्रतिरक्षा चोरी और पूर्ण डाह पूर्व vivo और vivo में के लिए आवश्यक है की अभिव्यक्ति की जांच करके इस प्रणाली की उपयोगिता का प्रदर्शन । हम बताते हैं कि nuc-gfp दृढ़ता से गुर्दे फोड़े में व्यक्त की है और विषम जीन अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ लगे फोड़े में nuc प्रमोटर गतिविधि के स्थानिक विनियमन के लिए भाग में कारण प्रकट होता है । विधि एक हेर-फेर आनुवंशिक प्रणाली और किसी भी संक्रमण मॉडल के साथ किसी भी जीवाणु के लिए लागू किया जा सकता है, नैदानिक अध्ययन और दवा के विकास के लिए बहुमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं ।

Introduction

जीवाणुओं को बदलने के लिए शारीरिक स्थितियों और उनके पर्यावरण के पोषण राज्य में परिवर्तन करने के लिए अंतर से अनुकूलन और अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन व्यक्त करने का जवाब । उदाहरण के लिए, अवसरवादी रोगजनकों उपनिवेश शरीर अपेक्षाकृत कम घनत्व पर सतहों, और अक्सर हानिरहित हैं । हालांकि, एक बार जीवाणु शारीरिक और रासायनिक बाधाओं प्रवेश किया है, यह मेजबान प्रतिरक्षा सेल काउंटर के साथ संघर्ष-गढ़ और सीमित पोषक तत्वों की उपलब्धता1होगा । एक उदाहरण के रूप में, Staphylococcus aureus उपनिवेश करता आबादी के लगभग एक तिहाई स्पर्शोन्मुख है, लेकिन यह भी विनाशकारी त्वचा और कोमल ऊतक संक्रमण, अस्थिमज्जा, अन्तर्हृद्शोथ, और bacteremia2के कारण है । एक रोगज़नक़ के रूप में aureus की सफलता अक्सर इसके चयापचय लचीलापन के साथ ही सतह से जुड़े और स्रावित डाह कारकों है कि जीवाणु खून से बचने के लिए और परिधीय ऊतकों में नकल करने के लिए सक्षम के एक शस्त्रागार के लिए जिंमेदार ठहराया है 3,4,5. क्योंकि मेजबान मौत स्ताफ्य्लोकोच्कल रोग के कारण एक विकासवादी मर अंत और नई मेजबान6के लिए संचरण की सीमा है, डाह कारक उत्पादन के लिए प्रतिबद्धता सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए ।

प्रोटीन और गैर कोडिंग RNAs के एक जटिल नियामक नेटवर्क सेल घनत्व, विकास चरण, न्युट्रोफिल जुड़े कारकों, और पोषक तत्वों की उपलब्धता, यह सुनिश्चित करने के लिए कि डाह जीन पर व्यक्त कर रहे है सहित पर्यावरणीय उत्तेजनाओं की एक किस्म का जवाब सटीक समय और मेजबान ऊतकों के भीतर स्थान7,8,9,10,11,12,13. उदाहरण के लिए, SaeR/S दो घटक सिस्टम (TCS) सेंसर कळेनासे (SaeS) और प्रतिक्रिया नियामक (SaeR)14के माध्यम से कई डाह कारकों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है । SaeS (जैसे, मानव न्युट्रोफिल पेप्टाइड्स [HNPs], calprotectin)8,15,16होस्ट संकेतों के जवाब में एक संरक्षित histidine अवशेषों पर autophosphorylated है । phosphoryl समूह तो SaeR पर एक aspartate अवशेषों को हस्तांतरित किया है, यह एक डीएनए के रूप में सक्रिय-बाध्यकारी प्रोटीन (SaeR ~ P)17। SaeR/एस टीसीएस 20 जीन है कि fibronectin बंधन प्रोटीन (FnBPs), leukocidins, और coagulase14,18,19,20सहित रोगजनन के लिए योगदान पर नियंत्रित करता है । लक्ष्य उच्च संबंध और कम समानता जीन लक्ष्य है, जो SaeR के स्तर के रूप में प्रेरित कर रहे है में वर्गीकृत किया जा सकता है ~ पी उगता है जब अपने संकेतों को उजागर21। SaeR/एस गतिविधि Agr कोरम संवेदन प्रणाली के रूप में जीन अभिव्यक्ति के अंय नियामकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है, विषाक्त पदार्थों के प्रोटीन के दमन (सड़ांध), और वैकल्पिक सिग्मा कारक बी (SigB)22,23,24।

nuc Staphylococcus aureus में एक Sae-निर्भर डाह जीन है और encodes thermonuclease (nuc), जो एनeutrophilic ईxtracellular टीraps (जाल) से बचने के लिए और के दौरान प्रसार के लिए आवश्यक है संक्रमण का कोर्स25,26. nuc की अभिव्यक्ति भी मजबूती से शाखाई-चेन अमीनो एसिड और GTP27की उपस्थिति में कोड़ी द्वारा अप्रत्यक्ष रूप से दमित है, और सीधे स्ताफ्य्लोकोच्कल गौण नियामक प्रोटीन सारा28,29 द्वारा दमित , जिनकी सक्रियता ऑक्सीजन (redox state) और pH30से प्रभावित होती है । यह देखते हुए कि sae और nuc म्यूटेंट संक्रमण के माउस मॉडलों में तनु हैं, वहां रासायनिक हस्तक्षेप है कि उनकी इसी गतिविधियों को रोकना26,31के विकास में रुचि है । बावजूद इसके संक्रमण के दौरान उनके नियमन के संबंध में कोई जानकारी नहीं है ।

फ्लोरोसेंट पत्रकारों की निगरानी और एकल कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति यों तो इस्तेमाल किया गया है । साथ ही, हम एसबढ़ाता के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । संक्रमण के दौरान aureus जीन अभिव्यक्ति है कि, जब इन विट्रो transcriptome विश्लेषण और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (श्रीमती) की तरह शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक के साथ युग्मित, प्रकट कर सकते हैं कैसे बैक्टीरियल फिजियोलॉजी vivo में विनियमित है और कुछ niches में पोषक तत्वों के सापेक्ष बहुतायत । विधि एक तंत्रीय आनुवंशिक प्रणाली के साथ किसी भी जीवाणु रोगज़नक़ के लिए लागू किया जा सकता है ।

जीनोम एकीकरण वेक्टर का अवलोकन ।

जीनोम एकीकृत वेक्टर pRB4 है ५०० आधार जोड़े प्रत्येक के ऊपर और नीचे के क्षेत्रों से एस aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene के लिए मुताबिक़ पुनर्संयोजन की सुविधा । pRB4 तापमान के प्रति संवेदनशील pMAD वेक्टर इरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध कैसेट (ermC) और thermostable बीटा galactosidase जीन bgaB नीले/recombinants३२की सफेद स्क्रीनिंग के लिए युक्त रीढ़ से ली गई है । इंजीनियर रिपोर्टर का निर्माण भी जीनोम एकीकरण और प्लाज्मिड उंमूलन के बाद चयन के लिए एक क्लॉरॅंफेनिकोल प्रतिरोध मार्कर (cat), साथ ही साथ EcoRI और SmaI साइटों को superfolder ग्रीन को ब्याज की नियामक क्षेत्र फ्यूज होता है फ्लोरोसेंट प्रोटीन (sGFP) (चित्रा 1) । यह ज्ञात है कि ribosome बंधन साइट (आरबीएस) के चुनाव रिपोर्टर की गतिविधि को प्रभावित करती है, और अक्सर अनुभवजंय अनुकूलन३३की आवश्यकता है । इस प्रकार, एक आरबीएस की आपूर्ति नहीं की है । यहां, देशी ribosome बंधन साइट जीन अभिव्यक्ति की एक और अधिक प्राकृतिक पैटर्न के लिए प्रदान किया जाता है, लेकिन अंय साइटों का इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल एवं उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर तनाव की पीढ़ी

  1. जीनोम एकीकृत pRB4 वेक्टर EcoRI और SmaI प्रतिबंध एंजाइमों के साथ अनुक्रमिक पचा । निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद, 25 डिग्री सेल्सियस पर pRB4 के 1 µ जी का उपयोग कर SmaI के साथ एक रात के पाचन की स्थापना की, और फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 के लिए दूसरा पाचन के साथ आगे बढ़ना प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए EcoRI जोड़कर । 20 मिनट के लिए ६५ ° c पर मशीन द्वारा एंजाइमों को निष्क्रिय ।
  2. पीसीआर जीनोमिक डीएनए से ब्याज की विनियामक क्षेत्र बढ़ाना (इस मामले में, एक ~ ३५० आधार युग्म डीएनए टुकड़ा युक्त thermonuclease [nuc] प्रवर्तक क्षेत्र), एक 5 ' EcoRI प्रतिबंध साइट और एक 3 ' SmaI प्रतिबंध साइट शामिल है । SmaI मान्यता अनुक्रम में-फ़्रेम के साथ अनुवाद प्रारंभ codon होना चाहिए । इस अध् ययन में पीसीआर ने आगे प्राइमरी oRB015 (5 '-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3 ') के साथ निर्माता की सिफारिशों के अनुसार उच् च निष्ठा वाले DNA पोलीमरेज़ का इस् तेमाल किया और रिवर्स प्राइमरी oRB016 ( 5 '-gggcataactaacacctctttctttttag-3 ') । एनीलिंग तापमान ५३ डिग्री सेल्सियस था । निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पीसीआर क्लीन-अप किट का उपयोग करके परिणामी अंश को शुद्ध करें ।
  3. १.१ कदम में प्रदर्शन के रूप में EcoRI और SmaI के साथ परिणामी पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट और pRB4 की एक ही साइटों के लिए पचा डीएनए टुकड़ा ligate के रूप में निर्माता द्वारा की सिफारिश की एकीकरण का निर्माण करने के लिए । ई. कोलाई में बंधाव मिश्रण परिचय और निर्माण अनुक्रम की पुष्टि करें ।
  4. Electroporate एस aureus तनाव RN4220 में निर्माण के रूप में पहले वर्णित३४। संक्षेप में, इलेक्ट्रो-सक्षम कोशिकाओं के ७० µ एल के साथ प्लाज्मिड के 1 µ g का उपयोग करें (१०० Ω, 25 µF, और B2 शोरबा में २.३ केवी) (1% [w/v] कैसिइन hydrolysate, २.५% [w/v] खमीर निकालने, २.५% [w/v] NaCl, ०.१% [w/v] K2पो4, ०.५% [w/v] ग्लूकोज) । स्वतंत्र तापमान (30 डिग्री सेल्सियस) पर tryptic सोया आगर (TSA) इरिथ्रोमाइसिन (5 µ जी एमएल-1) और 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-डी-galactopyranoside (एक्स-लड़की के साथ पूरक) पर इरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध (Emr) के लिए चयन करें ८० µ जी एमएल-1) । परिणामी transformants प्लाज्मिड-एनकोडेड β-galactosidase गतिविधि के कारण नीले हैं ।
    नोट: नैदानिक अलग में डीएनए के हस्तांतरण एक मजबूत प्रतिबंध-संशोधन बाधा३५के कारण अत्यंत कठिन है । इस प्रकार, एस aureus RN4220 फ्यूजन का निर्माण एक मध्यवर्ती प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया गया था क्योंकि यह कमी प्रतिबंध है और उच्च रूपांतरित करने वाला ।
  5. फेज तापमान पर electroporation या transduction मध्यस्थता स्वतंत्र३६ का उपयोग कर ब्याज की एस aureus USA300 तनाव को प्लाज्मिड स्थानांतरण । संक्षेप में, प्रचार Φ11 भोजी कणों पर 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 5 मिमी CaCl2 युक्त TSA प्लेट का उपयोग कर, और फिर एक ०.४५ µ एम फाइबर एसीटेट सिरिंज फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा निष्फल । transduce एस aureus तनाव एलएसी को Emrlysates का उपयोग करें ।
    नोट: एलएसी एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया नैदानिक अलग है कि पहले उंहें TSB माध्यम में धारावाहिक पारित होने से संवेदनशील बनाया गया था देशी प्लाज्मिड pUSA03 के तनाव का इलाज है कि उंहेंआर 37, 38प्रदान ।
  6. पहले३२वर्णित के रूप में गुणसूत्र में दो, क्रमिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन की घटनाओं के द्वारा निर्माण को एकीकृत । recombinants क्लॉरॅंफेनिकोल प्रतिरोधी (सेमीआर) TSA प्लेटों पर है 5 μg एमएल-1 क्लॉरॅंफेनिकोल, इरिथ्रोमाइसिन अतिसंवेदनशील (एर्मएस), और अब नीले रंग युक्त ।
    नोट: जब संभव हो, फिर से USA300 में फेज के माध्यम से चिह्नित संलयन परिचय-मध्यस्थता transduction के साथ जुड़े उत्परिवर्तनों के संचय से बचने के लिए इन विट्रो तनाव बीतने३९ और तापमान में बदलाव ।

2. पशु संक्रमण: इनोक्युलम, प्रणालीगत संक्रमण, और ऊतक प्रसंस्करण की तैयारी

  1. बैक्टीरियल इनोक्युलम की तैयारी
    1. लकीर एस aureus एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से रक्त आगर प्लेटों पर अलगाव के लिए ब्याज की उपभेदों । 16 के लिए ३७ ° c पर मशीन-24 एच रक्तलायी phenotypes की पुष्टि करने के लिए उनकी क्षमता के आधार पर लाइसे लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) और फार्म स्पष्ट पारदर्शी क्षेत्रों ।
    2. बाँझ ग्लास ट्यूबों में tryptic सोया शोरबा (TSB) के 4 मिलीलीटर के लिए प्रत्येक तनाव के inoculating एकल कालोनियों द्वारा रातोंरात संस्कृतियों शुरू करो । 16 के लिए ३७ ° c में ट्यूबों घुमाएं-24 एच एक ट्यूब रोलर में सेट लगभग एक ७० डिग्री कोण और प्रति मिनट ७० rotations [RPM] में ।
    3. कदम 2.1.2 से संस्कृतियों के ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने के लिए एक spectrophotometer का प्रयोग करें । एक ऑप्टिकल संदर्भ (रिक्त) के रूप में बाँझ माध्यम का उपयोग करें । इन कोशिकाओं को पतला एक आयुध डिपो में६०० ०.०५ के 25 मिलीलीटर में बाँझ Tryptic सोया शोरबा (TSB) अलग है, १२५ मिलीलीटर लंबी कुप्पी (5:1 कुप्पी मात्रा अनुपात करने के लिए) और एक जल स्नान में संस्कृतियों की गर्मी (संस्कृतियों को उचित ताप हस्तांतरण के लिए), २८० RPM पर मिलाते हुए और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए सेट ।
      नोट: इनोक्युलम की वृद्धि विभिन्न तरीकों से किया जा सकता है; घातीय चरण में कोशिकाओं को उगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत की है । बावजूद, यह लगातार टीका के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक ही विधि का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    4. के एक आयुध डिपो में६०० ~ 1, फिर से ताजा माध्यम में कोशिकाओं को पतला ०.०५ के एक प्रारंभिक आयुध डिपो६०० करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं घातीय चरण को प्राप्त करने और है कि कारक है कि रात भर की गर्मी के दौरान जमा करने के लिए घातीय चरण के स्तर को कम किया गया है ।
    5. फसल घातीय चरण के दौरान कोशिकाओं (आयुध डिपो६०० ~ 0.6-0.8) द्वारा ३,००० x g पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक ।
    6. दो बार बाँझ 1x फॉस्फेट-खारा (पंजाबियों, पीएच ७.४) के बराबर मात्रा में छर्रों धो.
    7. 1 x 108 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) एमएल-1 या वांछित प्रयोग के लिए उपयुक्त के रूप में एक एकाग्रता के लिए 1x पंजाब (पीएच ७.४) में कोशिकाओं को निलंबित ।
      नोट: यह एक ब्याज के तनाव के लिए आयुध डिपो६०० और CFU एमएल-1 के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि तनाव सेल आकार और आकार के निर्भर परिवर्तन प्रकाश बिखरने गुण और अंत में प्रभावित कर सकते हैं, इंफेक्शन की खुराक ।
  2. जानवरों और जीवाणु संक्रमण की तैयारी
    1. Acclimate चूहों पर 7 दिनों के लिए शुद्ध आहार ऐन-९३. आहार के लिए पर्याप्त पोषण प्रदान करने के लिए तैयार है, जबकि ऊतक ऑटो-प्रतिदीप्ति मानक माउस चाउ४०में प्रयुक्त संयंत्र के उपभोग के साथ जुड़े-आधारित अवयवों को कम करने ।
      नोट: Female C57/BL6 चूहों (6-8 सप्ताह पुराना) यहाँ उपयोग किया जाता है, लेकिन माउस तनाव और सेक्स अध्ययन पर निर्भर करेगा ।
    2. संक्रमण से पहले, गुनगुने पानी के साथ माउस पूंछ नसों का फैलाव ।
    3. एक प्रणालीगत संक्रमण का उत्पादन करने के लिए पूंछ नसों के माध्यम से बैक्टीरियल इनोक्युलम के १०० µ एल इंजेक्शन द्वारा पशुओं को संक्रमित । यदि प्रवाह cytometry (अनुभाग 4 देखें) के प्रारंभिक इनोक्युलम का कोई aliquot सहेजें ।
    4. जानवरों की निगरानी दैनिक और एक निगरानी प्रणाली की समीक्षा की है और एक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित का उपयोग कर अपने स्वास्थ्य की स्थिति का मूल्यांकन ।
    5. संक्रमण वांछित अवधि के लिए प्रगति की अनुमति दें । यहां, प्रयोग 3 दिनों के बाद संक्रमण समाप्त कर रहे हैं ।
      नोट: इन शर्तों के तहत, फोड़े बैक्टीरिया की एक स्ताफ्य्लोकोच्कल फोड़ा समुदाय से मिलकर बनता है, फाइब्रिन जमा द्वारा संलग्न है, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गाढ़ा परतों से घिरा हुआ5,४१।
  3. अंगों और ऊतक प्रसंस्करण संचयन
    1. सह2 साँस लेना और एक द्वितीयक विधि के रूप में गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन और प्रदर्शन necropsy द्वारा जानवरों Euthanize ।
    2. हार्वेस्ट गुर्दे (दाएं) और अंय महत्वपूर्ण अंगों (दिल, जिगर, फेफड़ों, तिल्ली) और 15 मिलीलीटर में हस्तांतरण 10% युक्त ट्यूबों [v/v] buffered formalin । इन अंगों के साथ आगे बढ़ने के लिए नीचे कदम 2.3.4 ।
    3. 2 मिमी सिलिका मोती और 1 मिलीलीटर बाँझ 1x (पीएच ७.४) के ~ ५०० µ एल युक्त एक बाँझ 2 मिलीलीटर प्रभाव प्रतिरोधी ट्यूब करने के लिए छोड़ दिया गुर्दे हस्तांतरण । ४.२ कदम के लिए इस अंग के साथ आगे बढ़ें ।
    4. कदम 2.3.2 से अंगों की अनुमति के लिए कोमल मिलाते हुए या रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर अंधेरे में ठीक से कम 24 घंटे के लिए, लेकिन अधिक से अधिक ४८ घंटे ।
    5. स्पष्ट ऊतक ठंड मध्यम में अंगों एंबेड और-८० डिग्री सेल्सियस पर ऊतकों की दुकान ।
    6. 10 µm मोटाई के स्लाइस में एक cryostat, अनुभाग ऊतक का उपयोग करना ।
    7. सूखी एक पूर्व पर वर्गों को साफ, अंधेरे में 20 मिनट के लिए चार्ज गिलास स्लाइड, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) दाग के साथ कठिन बढ़ते मध्यम लागू होते हैं, और coverslip लागू होते हैं । कमरे के तापमान पर रात भर स्लाइड का इलाज, और लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरण ।

3. लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोपी और इमेज प्रोसेसिंग

  1. उपयोग की जा रही फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए उपयुक्त पराबैंगनीकिरण का उपयोग कर घावों का पता लगाने के लिए घुड़सवार स्लाइड की जांच करें । इस स्थिति में, हरे (GFP), लाल (tdTomato), और नीले (DAPI) प्रतिदीप्ति संकेतों का उपयोग किया जाता है ।
  2. व्यक्तिगत कोशिकाओं को विज़ुअलाइज़ करने के लिए उपयुक्त उद्देश्य का उपयोग करके छवि प्राप्त करें (उदा., आमतौर पर 20x या 40x उद्देश्य उपयोग किए जाते हैं).
  3. फोकल छवियों में प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने ।
    1. छवि J में फोकल छवि खोलें और ठीक से घाव के प्रतिदीप्ति संकेत कल्पना करने के लिए चमक/कंट्रास्ट समायोजित करें ।
    2. रुचि के क्षेत्र को परिभाषित करें, और थ्रेशोल्ड विकल्प का उपयोग करके, आवश्यक के रूप में निचली और ऊपरी प्रतिदीप्ति सीमा सेट करें ।
    3. क्षेत्र का चयन करके केन्द्रक परिभाषित करें → मतलब ग्रे मूल्य → केन्द्रक → सीमा करने के लिए छवि J में विश्लेषण टैब के तहत सीमित
    4. केन्द्रक प्रतिदीप्ति तीव्रता मान निकालें या इकाई क्षेत्र (मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता, MFI) के लिए GFP और tdTomato के प्रति दिए गए घावों में मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने । यहां, एक µm2 के क्षेत्रों का इस्तेमाल किया गया ।
      नोट: एक अंधा दूसरा विश्लेषण पूर्वाग्रह को कम करता है जब नमूने की पहचान ज्ञात है ।
    5. प्लॉट डेटा और प्रत्येक तुलना के लिए उपयुक्त सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं ।

4. फ्लो Cytometry एनालिसिस

  1. वैकल्पिक संक्रमण के दिन पर इनोक्युलम के फ्यूजन गतिविधि का निर्धारण (धारा 2.2.3 से)
    1. 1x बाँझ पंजाबन (पीएच ७.४) के ८९९ µ एल करने के लिए जोड़ें १०० µ एल के प्रत्येक इनोक्युलम और 1 µ एल के झिल्ली permeant न्यूक्लिक एसिड दाग ( सामग्री की तालिकादेखें) । एक नियंत्रण के रूप में, एक नमूना कमी न्यूक्लिक एसिड दाग शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    2. सभी नमूनों पर फ्लो cytometry प्रदर्शन करते हैं ।
      नोट: बहुत पहले प्रयोग के लिए, यह एक वेक्टर हित के फ्यूजन के लिए केवल नियंत्रण के लिए उचित वोल्टेज का उपयोग करने के लिए निर्धारित शामिल उपयोगी है । सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों के बीच एक स्पष्ट जुदाई डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक है, रिपोर्टर का संकेत है अच्छी तरह से ऊपर पृष्ठभूमि संकेत है ।
    3. बैक्टीरियल जनसंख्या की पहचान करने के लिए, न्यूक्लिक एसिड दाग (y-अक्ष) और आगे बिखराव (x-अक्ष) का उपयोग करके प्लॉट ईवेंट.
    4. घटनाओं है कि दोनों न्यूक्लिक एसिड दाग सकारात्मक और जीवाणु के सही आकार आगे तितर बितर ( एस aureusके लिए ०.५ २.० µm के बीच) के आधार पर कर रहे है चारों ओर एक शामिल गेट ड्रा ।
      नोट: कठोर हो जब इस आबादी की पहचान के रूप में यह घटनाओं है कि इन मापदंडों के भीतर स्पष्ट रूप से शामिल है महत्वपूर्ण है । सुनिश्चित करें कि इस गेट अंय स्थितियों के तहत नकारात्मक नियंत्रण के लिए सभी घटनाओं शामिल नहीं है । इस अध्ययन में, मोटे तौर पर ७०% सेल जनसंख्या विश्लेषण में इन आवश्यकताओं से मुलाकात की ।
  2. बलि के बाद ऊतक नमूनों का विश्लेषण:
    1. जानवरों Euthanize, फसल छोड़ दिया गुर्दों (२.३ कदम देखें), और मनका-धड़कन में स्थानांतरण 1 1x बाँझ पंजाबियों (पीएच ७.४) की मिलीलीटर और २५० µ एल 2 मिमी borosilicate मोतियों की.
    2. बैक्टीरिया की कोशिकाओं को जारी करने के ऊतकों को बाधित. गुर्दे के लिए, कोशिकाओं को बाधित करने के लिए एक homogenizer का उपयोग करें । यहां, ३ ३० एस ६८०० rpm पर 1 ंयूनतम चक्र के बीच गीला बर्फ पर ठंडा अवधि के साथ फटने के नमूने हीटिंग को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा एक तालिका के microcentrifuge में 3 मिनट के लिए २५० x g पर केंद्रापसारक द्वारा बड़ा ऊतक मलबे गोली ।
      नोट: आमतौर पर, वहां ट्यूब के नीचे एक सेल गोली और शीर्ष पर तैरते मलबे की एक परत है । मध्य जलीय परत बैक्टीरियल कोशिकाओं शामिल हैं ।
    4. एक साफ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जलीय परत से 10 µ एल स्थानांतरण न्यूक्लिक एसिड दाग के 1 µ l के ९८९ µ एल में पंजाबियों (कुल मात्रा 1 मिलीलीटर) से युक्त ।
    5. एक ही डेटा प्राप्ति पैरामीटर और गेटिंग प्रारंभिक inocula के लिए का उपयोग करते हुए प्रवाह cytometry करें ।
      नोट: बैक्टीरियल कोशिका गिनती बहुत कम हो जाएगा क्योंकि नमूना मुख्य रूप से ऊतक मलबे शामिल हैं । "लाइव गेट" विकल्प भी इस्तेमाल किया जा सकता है अगर कोशिकाओं न्यूक्लिक एसिड दाग सकारात्मक और आकार gated जब डेटा आवेदन में लोड कर रहे हैं । यह भी लक्ष्य घटनाओं का अधिक विश्लेषण और फ़ाइल आकार को कम करने में मदद मिलेगी । प्रति नमूना लगभग १,०००,००० घटनाओं गिना जाता है, लेकिन अधिक घटना गिनती संक्रमण और ऊतक के आकार का विश्लेषण की गंभीरता के आधार पर आवश्यक हो सकता है ।
    6. डेटा विश्लेषण: निर्धारित एक दिए गए नमूने में प्रत्येक fluorophore के लिए अर्थ फ्लोरोसेंट तीव्रता (MFI) धारा 4.1.4 में निर्धारित शामिल गेट्स का उपयोग कर । प्रवाह विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में नमूनों को ईवेंट की गणना के अनुसार सामान्य करें. १०,००० गिनती आमतौर पर विश्लेषण में पर्याप्त हैं ।
      नोट: यह असामांय नहीं है कि नमूनों की घटनाओं की इस संख्या से कम होते है खोजने के बाद से यह फोड़ा गठन और संक्रमण गंभीरता पर निर्भर है । इस दृष्टिकोण का उपयोग, 500-40000 घटनाओं आमतौर पर संक्रमित ऊतक में पाए जाते हैं ।

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Representative Results

हम एक pMAD३२ है कि किसी भी रिपोर्टर संलयन डबल क्रॉसओवर मुताबिक़ पुनर्संयोजन (चित्रा 1) द्वारा गुणसूत्र में निर्माण उद्धार कर सकते से व्युत्पंन प्लाज्मिड विकसित की है । इस का निर्माण किसी भी विनियामक क्षेत्र है कि GFP प्रोटीन और पृष्ठभूमि के ऊपर फ्लोरोसेंट संकेत के उत्पादन का समर्थन करता है की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । प्लाज्मिड एम्पीसिलीन प्रतिरोध (एपीआर) रखरखाव और ई. कोलाई और इरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध में प्रचार के लिए (Emr) एस aureus में प्रदान । निर्माण भी क्लॉरॅंफेनिकोल प्रतिरोध (सेमीआर), जो परिष्कृत आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एस aureus में विभिंन उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच एकीकृत रिपोर्टर संलयन के आसान हस्तांतरण के लिए अनुमति देता है प्रदान ।

सिद्धांत के सबूत के रूप में, हम gfp. nuc के लिए nuc विनियामक क्षेत्र से जुड़े क्योंकि इसके जीन उत्पाद पूर्ण डाह के लिए आवश्यक है और एस मैक्रोफेज-प्रेरित फोड़े४२से aureus सीमित करने के लिए आवश्यक है चुना गया था, ४३. निर्माण गुणसूत्र में एकीकृत के रूप में कदम 1.4-1.6 प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया था । इसके बाद इंटीग्रेटेड फ्यूजन को AH3926 में ट्रांसफर कर दिया गया जिसमें एक पीsarAP1-tdTomato फ्यूजन शामिल है । सारा P1 प्रमोटर पहले दिखाया गया है constitutively सक्रिय४४ और इस प्रकार, सभी कोशिकाओं लेबल ।

हम पहले सत्यापित है कि रिपोर्टर संलयन के दौरान इन विट्रो में सक्रिय थे Tryptic सोया शोरबा (TSB; एक अमीर, जटिल माध्यम) में कुप्पी विकास हिला और प्रतिदीप्ति के स्तर सेलुलर ऑटो फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि (चित्रा 2) से ऊपर थे । कैसे फ्लोरोसेंट पत्रकारों vivo में व्यवहार का निर्धारण करने के लिए, एक संशोधित गुर्दे फोड़ा मॉडल5इस्तेमाल किया गया था । महिला C57BL के समूह/चूहों 1x107 CFU के साथ नसों के साथ चुनौती दी गई एस aureus एलएसी कोशिकाओं की कमी रिपोर्टर संलयन या लाख दोनों nuc- sGFP और sarAp1-tdTomato संलयन ले जाने कोशिकाओं । पशुओं को तीन दिन बाद संक्रमण की बलि दी गई । फिर, काटा अंगों में तय किया गया 10% [v/v] buffered formalin, क्रायो-खोदी गई, और DAPI धुंधला होने के बाद के रूप में कदम 2 और 3 में वर्णित फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged (चित्रा 3ए, बी) । छवि J और गुर्दे घावों में प्रति इकाई क्षेत्र प्रतिदीप्ति का उपयोग कर मापा गया था छवियों का विश्लेषण किया गया. के रूप में चित्रा 3सीमें दिखाया गया है, nuc-gfp फ्यूजन प्रतिदीप्ति औसत पर लगभग 9-रिपोर्टर फ्यूजन नहीं ले जा कोशिकाओं की तुलना में संलयन ले जाने कोशिकाओं में उच्च गुना था; बाद संकेत (ऑटो प्रतिदीप्ति) का पता लगाने की सीमा का गठन ( nuc-sGFP से एलएसी) की तुलना करें । इसी तरह, पीsarAP1-tdtomato फ्यूजन प्रतिदीप्ति था ~ 6 कोई रिपोर्टर नियंत्रण (चित्रा 3ईसे गुना अधिक, sarAP1-tdT बनाम एलएसी की तुलना) । प्रवाह cytometry का प्रयोग, रिपोर्टर गतिविधियों के पैटर्न गुर्दे homogenates और प्रवाह cytometry का उपयोग कर के रूप में चरण 4 में वर्णित की पुष्टि की थी, हालांकि प्रतिदीप्ति में गुना मतभेद कम थे (चित्रा 3डी, एफ) ।

दिलचस्प है, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर संलयन ले जाने कोशिकाओं द्वारा गठित घावों से प्रतिदीप्ति डेटा पत्रकारों की कमी से अधिक परिवर्तनशीलता दिखाने के लिए दिखाई दिया । हम सोच रहे थे कि क्या प्रतिदीप्ति मापन में भिंनता देखा संवाददाताओं की विषम अभिव्यक्ति के कारण था (है कि जैविक मूल के) । दरअसल, भीतर ~ १०० µm दूरी यह पाया गया कि कुछ घावों या तो एक या दोनों संवाददाताओं (चित्रा 4) व्यक्त की है । महत्वपूर्ण बात, स्ताफ्य्लोकोच्कल फोड़ा समुदायों में एकल सेल संकल्प के साथ रिपोर्टर गतिविधि का परीक्षण (SACs) मजबूत DAPI धुंधला के साथ फोड़ा घिरा में nuc अभिव्यक्ति के स्थानिक विनियमन से पता चला, के साथ जुड़े होने की संभावना गठन और न्युट्रोफिल extracellular जाल (चित्रा 5ए-सी)४५की रिहाई । उदाहरण के लिए, हम काफी उच्च nuc-sGFP फ्यूजन थैली के इंटीरियर कोर में प्रतिदीप्ति कि परिधि पर (चित्रा 5बी, ई) की तुलना में मापा । इसी फोड़े में sarAp1-tdTomato फ्यूजन प्रतिदीप्ति के लिए पैटर्न उल्टे (चित्रा ५डी) दिखाई दिया. हालांकि, पैटर्न सांख्यिकीय महत्वपूर्ण जानवरों की एक ही संख्या का उपयोग नहीं किया गया था (चित्रा 5एफ) ।

Figure 1
चित्रा 1 : जीनोम एकीकरण रिपोर्टर प्लाज्मिड pRB4 के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । प्लाज्मिड pRB4 aureus (ओरि pE194टीएस) में प्रतिकृति की एक तापमान संवेदनशील मूल के साथ pMAD के व्युत्पंन है । वहां तीन दवा प्रतिरोध मार्करों रहे हैं: (i) ब्लॅक, ई कोलाईमें एम्पीसिलीन प्रतिरोध को प्राथमिकता; (ii) ermC, इरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध को एस. aureusमें प्रदान करना; और (iii) कैट, क्लॉरॅंफेनिकोल के प्रतिरोध को एस aureusमें प्रदान करते हैं । रिपोर्टर का निर्माण डबल क्रॉसओवर मुताबिक़ पुनर्संयोजन और जीनोम एकीकरण के लिए pseudogene SAUSA300_0087 (संदर्भ जीनोम: FPR3757) के ऊपर और बहाव अनुक्रम से ~ ५०० बीपी प्रत्येक द्वारा पार्श्व है । sGFP, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन; सीएस, क्लोनिंग साइट; टीटी, मजबूत द्वि-दिशा transcriptional टर्मिनेटर. आंकड़ा पैमाने पर नहीं है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : मैं ntegrated nuc-sGFP और sarAp1-tdTomato रिपोर्टर्स के दौरान व्यक्त की हैं इन विट्रो ग्रोथ . एस aureus लाख कोशिकाओं (जंगली-प्रकार [WT]), के साथ और बिना (क) nuc-sGFP या (ख) sarAp1-tdTomato पत्रकारों) TSB में घातीय चरण के लिए बड़े हो गए थे और फिर से एक ही माध्यम में पतला । ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) और प्रतिदीप्ति संकेत ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों पर मापा गया । पृष्ठभूमि-घटाई प्रतिदीप्ति तीव्रता मान (उत्तेजना/उत्सर्जन: sGFP, 485/535 एनएम; tdTomato [tdT], 535/590 एनएम) के सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयां उत्पंन करने के लिए ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों से विभाजित किया गया । डेटा का अर्थ है +/-दो स्वतंत्र प्रयोगों से SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : फ्लोरोसेंट पत्रकारों गुर्दे ऊतक में दिखाई दे रहे हैं । के समूह 13 C57BL/चूहों लाख कोशिकाओं या एलएसी दोनों nuc-sGFP और sarAp1-tdTomato (tdT)ले जाने कोशिकाओं के साथ नसों में चुनौती दी थी, और संक्रमण तीन दिनों के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दी गई थी । चूहों euthanized थे, और अंगों के चरण 2 और 3 प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में संसाधित किए गए थे । प्रतिनिधि गुर्दा अनुभाग के लिए कई घावों और एसोसिएटेड प्रतिदीप्ति दिखा (क) nuc-sGFP और (ख) sarAp1-tdTomato। स्केल बार्स = २५० µm (10x उद्देश्य) । गुर्दे के घावों के साथ जुड़े प्रति इकाई क्षेत्र (RFU [माइक्रोन2]-1) सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों कदम ३.३ में वर्णित छवि विश्लेषण का उपयोग कर मापा गया और (ग) nuc-sGFP और (ई) के लिए साजिश रची गई sarAp1-tdTomato; प्रत्येक बिंदु एक घाव का प्रतिनिधित्व करता है और सलाखों के औसत से संकेत मिलता है; 3-5 घावों प्रति माउस का विश्लेषण किया । प्रवाह cytometry विश्लेषण के (D) nuc-sGFP और (च) sarAp1-tdTomato फ्यूजन प्रतिदीप्ति बैक्टीरियल आबादियों में संक्रमित गुर्दे homogenates से अलग तीन दिनों के बाद संक्रमण. मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) ठोस पट्टी द्वारा संकेत दिया है, और प्रत्येक डॉट एक गुर्दा है । एलएसी, रिपोर्टर जंगली प्रकार तनाव । सांख्यिकी: मान-Whitney Test; पी < ०.०५. डेटा दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. प्रतिदीप्ति चैनल के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य इस प्रकार हैं: DAPI, ४०५ एनएम; GFP, ४८८ एनएम; tdTomato, ५६१ एनएम । उत्सर्जित प्रतिदीप्ति डेटा तरंग दैर्ध्य की एक सीमा से अधिक एकत्र किए गए थे: DAPI, 419-481 एनएम; sGFP, 505-551 एनएम; tdTomato, 575-630 एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : फोड़े गुर्दे के ऊतकों में पत्रकारों की चर अभिव्यक्ति प्रदर्शन । 13 C57BL/के समूह 6 चूहों पूंछ-नस के माध्यम से एस aureus कोशिकाओं के 1 एक्स 107 CFU के साथ चुनौती दी थी । पशुओं को euthanized तीन दिन बाद इंफेक्शन हो गया । गुर्दे की कटाई, स्थिर, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (40x उद्देश्य) के लिए खंड के रूप में प्रोटोकॉल के चरण 2 में वर्णित किया गया । दिखाया गया है (A) nuc-sGFP और (B) sarAp1-tdTomato प्रतिदीप्ति के चर स्तर के साथ करीब निकटता में तीन घावों । (ग) staphylococci और मेजबान कोशिकाओं से न्यूक्लिक अम्ल को DAPI दाग से दर्शाया गया है. हरे और लाल चैनल (डी) में विलय कर रहे हैं । इसी तरह के परिणाम अन्य वर्गों में देखे गए. चित्र एक 40x उद्देश्य का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे; स्केल बार = 25 µm । प्रतिदीप्ति चैनल के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य इस प्रकार हैं: DAPI, ४०५ एनएम; GFP, ४८८ एनएम; tdTomato, ५६१ एनएम । उत्सर्जित प्रतिदीप्ति डेटा तरंग दैर्ध्य की एक सीमा से अधिक एकत्र किए गए थे: DAPI, 419-481 एनएम; sGFP, 505-551 एनएम; tdTomato, 575-630 एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : nuc-sGFP स्ताफ्य्लोकोच्कल फोड़ा सूक्ष्म वातावरण में स्थानिक विनियमित है । फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) की छवियां एक स्ताफ्य्लोकोच्कल फोड़ा समुदाय (सैक) द्वारा उत्पादित एस aureus तनाव एलएसी nuc-sGFP और sarAp1-tdTomato रिपोर्टर फ्यूजन ले जाने । दर्शाए गए है (A) nuc के लिए मर्ज किए गए चैनल -sGFP और sarAp1-tdtomato, (B) nuc-sGFP प्रतिदीप्ति (हरा), (C) DAPI न्यूक्लिक एसिड (नीला) का धुंधला होना, और (D ) sarAp1-tdTomato प्रतिदीप्ति (लाल) । तारांकन चिह्न कोर (केन्द्रक) में कक्षों को इंगित करता है और तीर परिधि पर कक्षों को इंगित करता है. (ङ) nuc-sGFP और (च) के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रताsarAp1-tdTomato कोर और थैली की परिधि में कोशिकाओं के लिए दिखाए जाते हैं । प्रतिदीप्ति चैनल के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य इस प्रकार हैं: DAPI, ४०५ एनएम; GFP, ४८८ एनएम; tdTomato, ५६१ एनएम । उत्सर्जित प्रतिदीप्ति डेटा तरंग दैर्ध्य की एक सीमा से अधिक एकत्र किए गए थे: DAPI, 419-481 एनएम; sGFP, 505-551 एनएम; tdTomato, 575-630 एनएम । डेटा 8 गुर्दे (प्रति माउस एक) से प्राप्त कर रहे हैं, और 1-2 घावों प्रत्येक गुर्दे से छवि थे । सलाखों के माध्य इंगित करते हैं । डैश्ड रेखा, पता लगाने की सीमा । सांख्यिकी: डेटा के सामांय वितरण, छात्र के टी परीक्षण (ख़राब), * * * *पी < ०.०५ । (स्केल बार = 20 µm; सभी छवियों पर लागू होता है.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

बैक्टीरियल संक्रामक रोगों एक बढ़ती स्वास्थ्य समस्या एंटीबायोटिक प्रतिरोध निर्धारकों४६के अधिग्रहण के कारण दुनिया भर रहे हैं । क्योंकि वातावरण की मेजबानी के लिए अनुकूलन विकास और संक्रमण के दौरान अस्तित्व के लिए आवश्यक है, रणनीति जीन अभिव्यक्ति प्रोग्राम है कि रोगज़नक़ स्वास्थ्य बढ़ाने के लिए उपयोगी चिकित्सकीय साबित हो सकता है लक्ष्यीकरण । ऐसा ही एक कार्यक्रम SaeR द्वारा नियंत्रित जीन का सेट है/एस दो घटक प्रणाली (टीसीएस), पहले दिखाया प्रतिरक्षा चोरी४७में एक आवश्यक भूमिका निभाने के लिए । SaeR/S कारकों की एक किस्म से प्रेरित है, सबसे विशेष रूप से न्यूट्रोफिल8,20के साथ जुड़े उन । संक्रमण के दौरान, aureus एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया जिसमें न्यूट्रोफिल और अन्य फ़ैगोसाइट संक्रमण2की साइट पर भर्ती कर रहे हैं । द्रवीकरण परिगलन और फाइब्रिन साठा का पालन करें, एक फोड़ा बनाने के लिए आगे ऊतक नुकसान४८को रोकने के । इन प्रतिरक्षा विशेषाधिकार प्राप्त साइटों के भीतर, एस aureus कोशिकाओं Sae-निर्भर जीन उत्पादों के एक नंबर का उपयोग करने के लिए फोड़ा reprogram के जीवाणु गुणा5,४८की सुविधा । एक Sae-निर्भर जीन, nuc, nuclease और metabolizes जाल के लिए कोड 2 ' का उत्पादन करने के लिए-deoxyadenosine४३मैक्रोफेज को मारने के लिए । इस प्रकार, Nuc एक महत्वपूर्ण स्रावित एंजाइम है कि पूर्ण डाह४२ के लिए आवश्यक है और vivo में व्यक्त किया जाता है (चित्रा 3, चित्रा 4, और चित्रा 5).

हालांकि एस aureus के डाह कारकों बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, कैसे जीवाणु मेजबान में बढ़ता है एक अध्ययन क्षेत्र है, के रूप में समझ कैसे अपने शरीर विज्ञान संक्रमण के दौरान विनियमित है । यहां हम बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति और एकल कोशिका स्तर पर व्यवहार की जांच के लिए एक विधि का वर्णन एक संशोधित एकीकृत सदिश का उपयोग कर है कि चयन के अभाव में प्लाज्मिड नुकसान के लिए चिंता का शमन । हमारी कार्यप्रणाली permeabilize सेल दीवारों के लिए बिना फोड़े में जीन अभिव्यक्ति के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है, और एंटीबॉडी और लेबलिंग के लिए की आवश्यकता के बिना । हम nuc-sGFP फ्यूजन के रूप में अच्छी तरह से sarAp1-tdTomato संलयन गुर्दे फोड़ा में एक तीव्र प्रणालीगत संक्रमण मॉडल में तीन दिनों के बाद संक्रमण के द्वारा गठित SACs के मजबूत अभिव्यक्ति का पता लगाया । हालांकि, प्रायोगिक डिजाइन के लिए अंय साइटों में जीन अभिव्यक्ति के बारे में सवालों के जवाब संशोधित किया जा सकता है । वास्तव में, क्योंकि C57BL/6 चूहों अपने ऊतकों से एस aureus स्पष्ट करने में असमर्थ हैं, जीवाणु कंकाल प्रणाली सहित विविध संरचनात्मक साइटों पर आक्रमण (हड्डियों और जोड़ों) और मस्तिष्क, दिल, तिल्ली, और जिगर, जिनमें से सभी अलग फिजियोलॉजी है आणि पोषक गुण५,४९. इस प्रकार, बहुत एस aureus का उपयोग करने के लिए मेजबान ऊतकों की प्रकृति जांच द्वारा सीखा जा सकता है । यह ध्यान दें कि यह ज्ञात है कि कुछ मेजबान niches प्रकृति में hypoxic है या अंयथा एक मजबूत ऑक्सीजन ढाल५०प्रदर्शन महत्वपूर्ण है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन गतिविधि के लिए आणविक ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है, और कुछ दूसरों५१से ऑक्सीजन आंशिक दबाव के प्रति संवेदनशील हैं । जबकि हम प्रतिदीप्ति फोड़ा के भीतर गहरे संकेत देखते हैं, परिमाण एक मूल्यवान समझना हो सकता है । क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल में उपयोग के लिए विकसित codon-अनुकूलित फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रयोग इस चिंता५२को कम करने के लिए किया जा सकता है । एक दूसरे को ध्यान दें बिंदु यह है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन (sGFP और tdTomato) रिपोर्टर इस अध्ययन में इस्तेमाल किया उपभेदों द्वारा उत्पादित स्थिर हैं । इसलिए, फ्लोरोसेंट डेटा प्रयोग के पाठ्यक्रम पर संचय के बजाय हाल ही में प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित । सृजन एक अस्थिर sGFP या tdTomato जीन युक्त निर्माण बहुत गतिशील प्रयोगों के लिए प्रणाली की उपयोगिता में वृद्धि होगी ।

रिपोर्टर प्रणाली यहां वर्णित एक शक्तिशाली उपकरण को मात्रात्मक इन विट्रो में जीन विनियमन अध्ययन और vivo मेंप्रदान करता है । क्योंकि रिपोर्टर गुणसूत्र पर एक प्रति में बनाए रखा है, प्रणाली अच्छी तरह से दृढ़ता से व्यक्त जीन के लिए अनुकूल है (है कि, उच्च प्रमोटर गतिविधि होने) । प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति का स्तर पता लगाने या पृष्ठभूमि ऑटो-प्रतिदीप्ति की सीमा के नीचे गिर सकता है, क्योंकि कृत्रिम जीन या अन्य नीच व्यक्त जीन दिखाई नहीं हो सकता है । यह ज्ञात है कि ribosome बंधन साइट (आरबीएस) रिपोर्टर फ्यूजन३३की गतिविधि को प्रभावित करता है । इस समस्या का एक संभावित समाधान के लिए एक मजबूत आरबीएस जैसे अनुवाद दीक्षा क्षेत्र (तिर)५३ का उपयोग करने के लिए या गुणसूत्र में ब्याज के प्रवर्तकों के मिलकर प्रतियां एकीकृत है । वैकल्पिक रूप से, स्थिर बहु-प्रतिलिपि plasmids५४इस्तेमाल किया जा सकता है ।

वर्णित विधि की एक सीमा है कि, आरएनए से एक सीडीएनए तैयारी के विपरीत ऊतकों से निकाले, जीन की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या एक साथ पूछताछ की जा सकती है (वर्णक्रमीय ओवरलैप के बिना उपलब्ध फ्लोरोसेंट चैनलों द्वारा सीमित). तथापि, क्या प्राप्त की है संभावित अधिक जानकारीपूर्ण जा सकता है । qRT-पीसीआर और अन्य readouts कि औसत थोक आबादी संक्रमण के स्थल पर जनसंख्या विविधता पर कब्जा करने में असमर्थ हैं । वास्तव में, हम nuc-sGFP और sarAp1-tdTomato अभिव्यक्ति के स्तर में बंद निकटता में फोड़ा घावों के बीच विविधता मनाया (चित्रा 4) । यह क्या हाल ही में Cassat एट अल द्वारा सूचित किया गया था के समान है । ५५ इस समय, इस विविधता की उत्पत्ति ज्ञात नहीं है । हालांकि, पोषक तत्वों की उपलब्धता, पोषक तत्व अधिग्रहण प्रणालियों के चर प्रेरण, या अंय मेजबान कारकों संभवतः घटना की व्याख्या कर सकता है । इसके अलावा, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत अंगों या फोड़े कि जटिल तीन आयामी संरचना और विभिंन प्रकार के सेल के microenvironments के भीतर होता है । इन संरचनाओं के भीतर, ऊतकों काफी पीएच, osmolarity, ऑक्सीजन, और पोषक तत्वों की उपलब्धता, एक चयापचय zonation५६,५७के रूप में जाना जाता घटना के संबंध में भिंन हो सकते हैं । हम serendipitously की खोज की है कि स्थानिक विनियमन का एक पैटर्न जंगली-प्रकार फोड़ा (चित्रा 5) में रहने वाले कोशिकाओं में उठता है । यह हमारे ज्ञान के लिए है एक ग्राम में अपनी तरह का पहला अवलोकन-सकारात्मक रोगज़नक़ संक्रमण के दौरान । स्थानिक विनियमन यहां की सूचना दी है कि डेविस एट अल द्वारा प्राप्त करने के समान है । प्लीहा में microcolonies युक्त ऊतक-नकारात्मक रोगज़नक़ Yersinia pseudotuberculosis५८। उस उदाहरण में, नाइट्रिक ऑक्साइड का उत्पादन किया मेजबान (नहीं *) नाइट्रिक ऑक्साइड dioxygenase (Hmp) के उत्पादन के लिए microcolony निकटतम की परिधि पर कोशिकाओं में उत्तेजित नहीं *, आंतरिक कोशिकाओं को छोड़ Hmp की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने की जरूरत है । स्ताफ्य्लोकोच्कल फोड़े में, nuc अभिव्यक्ति थैली के मूल में सबसे मजबूत है, और परिधि के साथ सबसे कमजोर । क्योंकि फोड़े न्यूट्रोफिल के एक कफ से घिरे हैं, यह अटकलें है कि न्युट्रोफिल-व्युत्पंन cues staphylococci के व्यवहार का मार्गदर्शन कर रहे है मोहक है, दो phenotypically विशिष्ट आबादी में कोशिकाओं ध्रुवीकरण morphogenic की याद ताजा उच्चतर जीवन में विकास के दौरान विभेद का विनियमन५९. इस परिपाटी का यंत्रवत underpinning अज्ञात है और हमारी प्रयोगशाला में गहन अध्ययन का विषय है ।

हमारा मानना है कि हमारी विधि संक्रमण के दौरान व्यक्तिगत कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के ठीक विस्तार का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रदान करता है । विधि का पालन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है और अंत में ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति के विविधता और स्थानिक पैटर्न के शारीरिक मूल को समझते हैं । इस विषम व्यवहार को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब नए उपचार विधियों का विकास, केवल कोशिकाओं के एक उपजनसंख्या के रूप में (यानी, जीन एक्सप्रेस उन) चिकित्सकीय द्वारा लक्षित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम पीsarAP1-tdTomato फ्यूजन के उपहार के लिए अलेक्जेंडर Horswill धंयवाद, और करेन Creswell प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ मदद के लिए । हम भी सांख्यिकीय विश्लेषण पर सलाह के लिए एलिसा राजा धंयवाद । इस काम के हिस्से में एक NIH खोजपूर्ण/विकासात्मक अनुसंधान पुरस्कार (अनुदान AI123708) और SRB के लिए संकाय स्टार्टअप कोष द्वारा वित्त पोषित किया गया । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और व्याख्या, या प्रकाशन के लिए काम प्रस्तुत करने का निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

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References

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Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz, M. S., Brinsmade, S. R. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (144), e59055, doi:10.3791/59055 (2019).

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