Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Kaiwen  Ivy Liu; Norfala-Aliah  Binte Sutrisnoh; Yuanming Wang; Meng How Tan

doi:10.3791/59086

JoVE Journal > Genetics

遗传学

Edição do genoma em linhas de células de mamíferos usando CRISPR-Cas

Published: April 11, 2019

doi:

10.3791/59086

Kaiwen Ivy Liu, Norfala-Aliah Binte Sutrisnoh, Yuanming Wang², Meng How Tan²

¹Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, ²School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

CRISPR-Cas é uma tecnologia poderosa para projetar os genomas complexos de plantas e animais. Aqui, detalhamos um protocolo eficiente editar o genoma humano usando diferentes endonucleases de Cas. Destacamos importantes considerações e parâmetros de projeto para otimizar a eficiência de edição.

Abstract

O sistema regularmente intercaladas curta palíndromo repetições (CRISPR) em cluster funciona naturalmente na imunidade adaptativa bacteriana, mas tem com êxito foi realocado para engenharia do genoma em muitos organismos vivos diferentes. Mais comumente, a sua CRISPR associado 9 (Cas9) ou Cas12a endonuclease é usado para decompor a locais específicos no genoma, após o qual o intervalo de dupla-hélice do DNA é reparado através de fim não-homóloga aderir a caminho (NHEJ) ou o reparo de homologia-dirigido ( Caminho HDR) dependendo se é um modelo de doador ausentes ou apresentam respectivamente. Até à data, sistemas CRISPR de diferentes espécies bacterianas foram mostrados para ser capaz de realizar a edição de genoma em células de mamíferos. No entanto, apesar da aparente simplicidade da tecnologia, vários parâmetros de projeto precisam ser considerados, que muitas vezes deixam perplexos sobre como melhor realizar seu genoma edição de experiências de usuários. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo de delineamento experimental para identificação de clones de células que levam a modificações de DNA desejadas, com o objetivo de facilitar a execução bem-sucedida do genoma edição experimentos em linhas de células de mamíferos. Destacamos as considerações-chave para que os usuários anotem, incluindo a escolha do sistema CRISPR, o comprimento do espaçador e o design de um modelo de doador single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN). Vislumbramos que este fluxo de trabalho será útil para estudos de gene nocaute, doença modelagem esforços, ou linhas de célula a geração de repórter.

Introduction

A capacidade para projetar o genoma de qualquer organismo vivo tem muitas aplicações biomédicas e biotecnológicas, como a correção da doença-causando mutações, construção de modelos de celulares precisos para estudos de doença, ou geração de produtos agrícolas culturas com características desejáveis. Desde a virada do século, diversas tecnologias foram desenvolvidas para a engenharia do genoma em células de mamíferos, incluindo meganucleases¹^,²^,³, zinco dedo nucleases⁴^,⁵, ou transcrição como ativador effector nucleases (TALENs)⁶^,⁷^,⁸^,⁹. No entanto, estas tecnologias anteriores são difíceis de programa ou tedioso para montar, prejudicando, assim, sua adoção generalizada na investigação e a indústria.

Nos últimos anos, o cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) – sistema CRISPR-associado (Cas) tem emergido como um poderoso novo genoma engenharia tecnologia¹⁰^,¹¹. Originalmente um sistema imune adaptativo em bactérias, tem sido com sucesso implantado para a modificação do genoma em plantas e animais, incluindo seres humanos. Uma razão principal por que CRISPR-Cas ganhou tanta popularidade em tão pouco tempo é que o elemento que traz a chave endonuclease de Cas, tais como Cas9 ou Cas12a (também conhecido como Cpf1), para o local correto no genoma é simplesmente um pedaço curto de quimérico único guia RN Um (sgRNA), que é simples para o projeto e barato para sintetizar. Depois de ser recrutado para o site de destino, a enzima Cas funciona como um par de tesouras moleculares e cliva o DNA acoplado com sua RuvC, HNH ou Nuc domínios¹²^,¹³^,¹⁴. A resultante quebra encalhada dobro (DSB) é posteriormente reparada pelas células através de fim não-homóloga (NHEJ) juntar-se ou no caminho de reparação homologia-dirigido (HDR). Na ausência de um modelo de reparação, o ORL é reparado por via NHEJ propenso a erro, que pode dar origem a pseudo-aleatório inserção ou supressão de nucleotídeos (puntuais) no local do corte, potencialmente causando frameshift mutações nos genes codificantes de proteínas. No entanto, na presença de um modelo de doador que contém as alterações de DNA desejadas, o ORL é reparado por via HDR de alta fidelidade. Tipos comuns de modelos de doadores incluem oligonucleotides single-stranded (ssODNs) e plasmídeos. O primeiro costuma ser usado se as alterações de DNA pretendidas são pequenas (por exemplo, a alteração de um único par de base), enquanto o último é geralmente usado se deseja inserir uma sequência relativamente longa (por exemplo, a sequência de codificação de uma proteína verde fluorescente ou GFP) para o local de destino.

A atividade de endonuclease da proteína Cas requer a presença de um motivo protospacer adjacentes (PAM) para o local de destino¹⁵. O PAM de Cas9 é na extremidade 3′ da protospacer, enquanto o PAM de Cas12a (também chamado Cpf1) é, ao invés, na extremidade 5′¹⁶. O Cas-guia complexo RNA é incapaz de apresentar um ORL se o PAM estiver ausente¹⁷. Daí, o PAM coloca uma restrição na genômicas locais onde um determinado nuclease Cas é capaz de decompor. Felizmente, nucleases de Cas de diferentes espécies bacterianas geralmente apresentam exigências diferentes do PAM. Portanto, integrando vários sistemas CRISPR-Cas em nossa caixa de ferramentas de engenharia, podemos expandir a gama de sites que podem ser alvo de um genoma. Além disso, uma enzima natural do Cas pode ser projetada ou evoluiu para reconhecer sequências de PAM alternativas, ainda mais, alargar o âmbito da genômicos alvos acessíveis para manipulação de¹⁹^,¹⁸^,²⁰.

Embora vários sistemas CRISPR-Cas estão disponíveis para fins de engenharia do genoma, a maioria dos usuários da tecnologia dependem principalmente da nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) por várias razões. Em primeiro lugar, requer um PAM relativamente simplesmente NGG, ao contrário de muitas outras proteínas de Cas que podem cleave apenas na presença de PAMs mais complexas. Em segundo lugar, é a primeira endonuclease Cas seja implantado com sucesso em células humanas²¹^,²²^,²³^,²⁴. Em terceiro lugar, SpCas9 é, de longe, a melhor enzima caracterizada até à data. Se um pesquisador deseja usar outro nuclease Cas, ele ou ela muitas vezes seria incerto sobre qual a melhor forma de projetar o experimento e bem como outras enzimas irão realizar em diferentes contextos biológicos em relação ao SpCas9.

Para fornecer clareza para o desempenho relativo dos diferentes sistemas de CRISPR-Cas, recentemente Efetuamos uma comparação sistemática de cinco endonucleases de Cas-SpCas9, a enzima Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9), a enzima Cas9 de Neisseria meningitidis (NmCas9), a enzima Cas12a de SP Acidaminococcus BV3L6 (AsCas12a) e a enzima Cas12a de bactéria Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)²⁵. Para uma comparação justa, avaliamos as nucleases de Cas diferentes usando o mesmo conjunto de sites de destino e outras condições experimentais. Os parâmetros de projeto de estudo também delineado para cada sistema CRISPR-Cas, que serviu como uma referência útil para os usuários da tecnologia. Aqui, para melhor permitir aos investigadores fazer uso das CRISPR-Cas sistema, nós fornecemos um protocolo passo a passo para engenharia de genoma ideal com diferentes enzimas Cas9 e Cas12a (ver Figura 1). O protocolo inclui não apenas detalhes experimentais, mas considerações de design também é importante para maximizar a probabilidade de um resultado de sucesso do genoma engenharia em células de mamíferos.

Figura 1 : Uma visão geral do fluxo de trabalho para gerar o genoma edição linha celular humana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. design de sgRNAs Selecione um sistema adequado de CRISPR-Cas. Primeiro, inspecione a região de destino para as sequências de PAM de todas as nucleases Cas9 e Cas12a que foram mostradas para ser funcional em células de mamíferos16,21-32. Cinco enzimas usadas com frequência são descritas na tabela 1 , juntamente com seus respectivas PAMs.Nota: além das endonucleases listados na tabela 1, há outras enzimas Cas menos comumente usadas que foram impl…

Representative Results

Para executar um genoma edição experimento, um plasmídeo CRISPR expressando uma sgRNA como alvo que o locus de interesse precisa ser clonado. Primeiro, o plasmídeo é digerido com uma enzima de restrição (normalmente um tipo de enzima do IIs) para linearizá-lo. É recomendável para resolver o produto digerido em um gel de agarose 1% ao lado de um plasmídeo não digerido para distinguir entre uma digestão completa e parcial. Como plasmídeo não digerido supercoiled, eles tendem a correr mais rápido do que suas…

Discussion

O sistema CRISPR-Cas é uma poderosa, revolucionária tecnologia para projetar os genomas e transcriptomes de plantas e animais. Numerosas espécies bacterianas foram encontradas para conter sistemas CRISPR-Cas, que potencialmente podem ser adaptados para o genoma e transcriptoma fins⁴⁴de engenharia. Embora a endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) foi a primeira enzima a ser implantado com sucesso em células humanas²¹^,^22<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. é suportado por uma agência de tecnologia da ciência e da pesquisa concessão de escritório comum do Conselho (1431AFG103), um Conselho Nacional de pesquisa médica grant (OFIRG/0017/2016), Fundação Nacional de pesquisa concede (NRF2013-THE001-046 e NRF2013-THE001-093), um Concessão do Ministério da educação Tier 1 (RG50/17 (S)), uma startup grant da Universidade Tecnológica de Nanyang e fundos para a competição internacional geneticamente engenharia máquina (Medren) da Universidade Tecnológica de Nanyang.

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400,000 units/ml
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit	Thermo Scientific	K1423	An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Scientific	451245	The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Broth (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L3022	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L2897	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
SOC media	–	–	2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose	Hyclone	SH30081.01	4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160	FBS is heat inactivated before use at 56 ^oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X	Gibco	20012
jetPRIME transfection reagent	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit	Bioline	BIO-52067	An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3	Merck	539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X	Bio-Rad	1610772	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X	1st base	BUF-2020	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1st base	BUF-3030	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Skim Milk for immunoassay	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
Antibody for β-actin (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Lot number: C0916
MiSeq system	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit fluorometer	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7	Addgene	108379	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9	Addgene	41815	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

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Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).