转基因 lck:eGFP 斑马鱼在T淋巴细胞中高表达GFP，已被用于研究T细胞发育及急性淋巴细胞白血病。该品系也可用于研究B细胞，因为B细胞以较低水平表达lck。本方案描述了从lck:eGFP斑马鱼中纯化恶性与非恶性B细胞的方法。
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方法文章
从 lck:eGFP 斑马鱼中分离恶性与非恶性B细胞
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
斑马鱼（Danio rerio）是研究淋巴细胞发育的有力模型。与哺乳动物类似，D. rerio 具有包含B细胞和T细胞的适应性免疫系统。由于目前普遍缺乏识别 D. rerio 细胞表面标志物的抗体，对斑马鱼淋巴细胞生成的研究较为困难，这使得包括B系细胞在内的不同淋巴细胞群体的分离与鉴定变得复杂。为克服这一挑战，通常使用带有谱系特异性荧光蛋白表达的转基因品系。转基因品系 lck:eGFP 已被用于研究 D. rerio T细胞的发育，并被应用于T细胞发育及T细胞急性淋巴母细胞白血病（T-ALL）的建模。尽管 lck:eGFP 斑马鱼已被广泛用于T系细胞分析，但尚未用于B细胞的研究。最近，我们发现许多斑马鱼B细胞也表达 lck，尽管表达水平较低。因此，lck:eGFP B细胞同样表现出低水平的GFP表达。基于这一发现，我们开发了一种从 lck:eGFP 斑马鱼中纯化B系细胞的方案，本文对此进行报道。本方法描述了如何利用荧光激活细胞分选仪（FACS）从 lck:eGFP 斑马鱼或相关品系（如双转基因 rag2:hMYC; lck:eGFP 斑马鱼）中纯化B细胞。在这些品系中，B细胞（尤其是未成熟B细胞）以较低但可检测的水平表达GFP，从而可与高表达GFP的T细胞区分开来。B细胞可从骨髓、胸腺、脾脏、血液或其他组织中分离。本方案提供了一种新的方法用于纯化 D. rerio B细胞，有助于开展针对B细胞发育及B淋巴细胞恶性肿瘤等主题的研究。
引言
斑马鱼具有多种显著优势，例如可进行遗传操作、繁殖力高、身体透明且发育迅速，这些特性有助于利用遗传学方法研究脊椎动物的发育过程。这些优势，加上硬骨鱼类与哺乳动物在造血过程中的共同特征，使得D. rerio成为研究淋巴细胞生成及其功能的理想模型，可从幼体最早出现淋巴细胞阶段一直延续至成体阶段进行活体分析。斑马鱼的血液发育依赖于与哺乳动物高度保守且共有的遗传机制，这些机制同样延伸至适应性免疫系统。此外，调控淋巴系发育的分子机制在斑马鱼与哺乳动物之间也表现出显著的保守性1。
在过去的20年中，转基因 D. rerio 已构建出可标记特定血细胞谱系及这些谱系缺陷型突变体品系的果蝇品系2,3,4,5其中一个，即 lck:eGFP 转基因品系，使用斑马鱼淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶（lck) 启动子以驱动 GFP 表达6该基因在T系前体细胞和成熟T淋巴细胞中均高表达，可用于体内追踪胸腺T细胞发育过程，以及通过流式细胞术对T系细胞进行体外分离纯化。
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方案
所有涉及斑马鱼的实验程序均经俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 从转基因 lck:eGFP 鱼中分离非恶性B和T淋巴细胞
- 使用含有0.02%三卡因（MS-222）的养殖水对鱼类进行麻醉。
- 检查2–6月龄的鱼类是否存在荧光性胸腺，该器官位于斑马鱼及其他硬骨鱼类鳃腔的背内侧区域14。使用落射荧光显微镜（激发波长470/40，发射滤光片525/50）检测GFP信号。
- 提前准备50 mL经滤膜灭菌的1×罗斯韦尔公园纪念研究所培养基（RPMI），其中含1%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（分选培养基）。未使用的分选培养基可在4 °C保存最多2个月。
- 将鱼置于含有0.2%三卡因的烧杯中约5分钟，随后浸入冰浴中以实施安乐死。通过观察鳃盖（鳃）运动是否停止来确认死亡。
- 将已安乐死的鱼置于培养皿中，在荧光显微镜下分离GFP+胸腺14，在明场显微镜模式下分离肾髓和脾脏15。本文所示结果来自3月龄鱼。淋巴细胞比例及绝对数量随年龄和基因型而异（详见讨论部分）。
- 将每份分离的器官放入含有500 µL冷分选培养基的1.5 mL离心....
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结果
我们采用流式细胞术分析并利用荧光激活细胞分选技术分离GFPlo 和 GFP你好 胸腺、肾髓质和脾脏的细胞 lck:eGFP 转基因斑马鱼。对3个月大的鱼进行分析发现，胸腺主要含有GFP+ 淋巴细胞。GFP+ 细胞主要局限于Traver等人先前描述的淋巴细胞门区域。17两种不同的GFP+ 种群，GFPlo和 GFP你好,能 可在胸腺中观察到GFP你好 淋巴细胞所占比例较高，约为60%，而GFPlo 细胞数量较少，约占胸腺淋巴细胞总数的40%（表1）。与哺乳动物不同，鱼类的造血骨髓位于肾脏内，而非骨骼中。我们发现肾脏骨髓中定居的B细胞也表达低水平的GFP（图2B 和
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讨论
我们开发并提供了一种从lck:eGFP转基因斑马鱼中分离B细胞的实验方案，从而将这一模型补充到其他带有B系标记的D. rerio模型中3,4。令人略感意外的是，自2004年该品系被报道以来，其中GFPlo B细胞的存在一直未被发现。通常认为lck是T细胞特异性的6，但近期研究发现自然杀伤细胞和髓系细胞中存在意外的lck表达，本文结果也显示B细胞中同样存在该表达18,19。与我们发现斑马鱼B细胞为GFPlo表型一致，人类的前B细胞、初始B细胞及成熟B细胞也均表达低水平的LCK11,13。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢Megan Malone-Perez在斑马鱼饲养方面提供的帮助，以及俄克拉荷马大学健康科学中心流式细胞术核心实验室的支持。本工作获得了资助 由现代希望之轮基金会、俄克拉荷马科学与技术发展中心（HRP-067）以及美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所INBRE试点项目资助（P20 GM103447）。JKF 担任 E.L. & 儿童医院基金会资助的儿科血液学-肿瘤学Thelma Gaylord冠名主席
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 µm 网格滤膜 | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 带细胞筛帽的 5 mL 聚苯乙烯圆底管 | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL 锥形管 | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 荧光显微镜 | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC 相机 | Nikon | ||
| 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222） | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | 参见 Langeneu 等，2004 | ||
| NIS Elements 软件 | Nikon | 版本 4.13 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333 | |
| 微型研磨管匀浆器 | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| 塑料移液管 | |||
| rag2:hMYC-ER | 参见 Gutierrez 等，2011 | ||
| RPMI 1640 培养基（1x） | Life Technologies | 11835-030 |
参考文献
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Jo....
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重印与许可
