プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化
Summary
ここでは、単一分子レベルの複雑な蛋白質のサンプルのそれぞれのタンパク質種のラベリングの均質性を評価するためのプロトコルを提案する.
Abstract
細胞のプロテオームは細胞内蛋白質のすべての種が非具体的蛍光染料と分類され、次の彼らの分離器によって斑点を付けられる電気泳動法の試金を使用して頻繁に特徴付けられます。単一分子蛍光イメージングは、個々 の蛍光分子を可視化するための能力を超高感度タンパク質検出を提供できます。ただし、この強力なイメージング法の電気泳動の試金への応用はプロテオームの間でそれぞれの蛋白質種の蛍光標識の均一性を特徴付ける方法の欠乏によって妨げられます。ここでは、単一分子蛍光イメージング法に基づくプロテオームのラベリングの均質性を評価する方法を開発しました。HeLa 細胞サンプル、我々 は ‘占有ラベル’ と呼ばれる少なくとも 1 つの色素の付いたタンパク質の割合を使用して私たちの測定 (LO)、決定された範囲に 50% から 90%、サポートする単一分子イメージングの応用の可能性が高いから高感度・高精度のプロテオーム解析。
Introduction
セルで表されるタンパク質分子の全体セットを定量化することを目的としたプロテオーム解析は、現在の生物学的および薬効がある研究の貴重なアプローチです。この分析は、よくタンパク質イオン1,2,3を介して生成されたスペクトルに基づく蛋白質種を識別する質量に依存します。プロテオーム解析の方法として、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) を含む電気泳動、キャピラリー電気泳動、二次元 (2 D) ゲルの電気泳動。このメソッドは、非固有電気泳動分離と検出および各蛋白質種の定量化分析の細胞のすべてのタンパク質分子の蛍光標識に依存します。必要な非特異的タンパク質ラベリングを実現、1 つの戦略はブルーと可視ルビー4,5,6 などの静電場と疎水性相互作用によるタンパク質に結合することができます蛍光染料を使用するには.代替戦略 N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステルまたはマレイミド、第一級アミン、チオールなど一般的な残基をタンパク質に結合することができます共有、それぞれ7,を含む染料で共有結合性ラベリングを使用することです。8。
一方、蛍光検出の感度は、低豊富なタンパク質と細胞の小さな数字の分析に最適です。単一分子蛍光イメージングは個々 の蛍光染料と in vitro 試験および in vivo9,10、11,12、分類された蛋白質の検出を可能にする最も敏感な方法の一つです。 13,14,15。このイメージング法の電気泳動を用いたプロテオーム解析への応用は、個々 の蛍光標識したタンパク質をカウントすることにより高感度・定量的アッセイを有効にする予定です。ただし、不明のままかどうか蛍光染料と分類は十分なすべての蛋白質分子の間で、種のタンパク質 (図 1) は、この均質性の影響について。単純なバルク溶液測定を使用して、’結合効率’8または 『 効率をラベリング 』 と呼ばれるタンパク質に蛍光染料のモル比を取得できますが、このプロパティ間ラベルの均質性に関する情報は提供しません蛋白質分子。
ここでは、セル (図 2)16のすべての蛋白質種のラベリングの均質性を調査するための試金のためのプロトコルについて述べる。この試金の 2 つの手順では、蛋白質の浄化およびイメージング。最初のステップで、細胞のすべてのタンパク質を蛍光に分類し、ビオチン化、個別に電気泳動を使用して得られる electroelution が続きます。2 番目の手順では、単一分子イメージングに基づく抽出サンプル中の個々 のタンパク質分子の蛍光特性が評価されます。このデータからタンパク質の割合が少なくとも 1 つ付いたようカウント分析の重要なパラメーターを染める、これラベリング占有 (LO)16と呼んで、蛍光染料の平均数は単一のタンパク質分子にバインド (n̄色素)、特徴付けることができます。プロトコルでは、NHS エステル系シアニン 3 (Cy3) 染料と HeLa 細胞のプロテオームの分類のための最適化されたプロシージャは、例として提示し、希望する研究の目標によると他のラベルの手順で変更できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、SDS-PAGE (ステップ 3) を分離した後の分類された蛋白質種のセルのラベルの均質性を定量化するためのプロトコルについて説明します。分離法は、分離と23特別な装置を必要としながら高解像度の細胞蛋白質の分別を許可する液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動などの他の方法で置き換えることが。現在のプロトコルの NHS エステルを使用してラベリン?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、実験の支援やアドバイスを大野雅恵と西村和哉をありがとうございます。この作品は、さきがけ (JPMJPR15F7)、日本科学技術振興機構、若い科学者 (A) (24687022)、挑戦的萌芽研究 (26650055)、革新的な領域 (23115005) 会科学研究費補助金に支えられ医療・創薬研究の推進学と武田科学財団持田記念財団からの補助金によって。S. l. は、理化学研究所国際プログラムに関連付ける (IPA) プログラムからのサポートを認めています。
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg, Biomedical Image Processing. Computer. 16 (1), 22-34 (1983).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
