Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per valutare l’omogeneità d’etichettatura per ogni specie di proteine in un campione di proteina complessa a livello di singola molecola.
Abstract
Proteomi cellulari sono spesso caratterizzati utilizzando dosaggi di elettroforesi, dove tutte le specie delle proteine nelle cellule non specifico sono marcate con un colorante fluorescente e sono individuate da una cellula fotoelettrica dopo la loro separazione. Formazione immagine di fluorescenza di singola molecola può fornire rilevamento ultrasensibile della proteina con la sua capacità per la visualizzazione di singole molecole fluorescenti. Tuttavia, l’applicazione di questo potente metodo di imaging a saggi di elettroforesi è ostacolata dalla mancanza di modi per caratterizzare l’omogeneità dell’etichettatura fluorescente di ogni specie di proteine attraverso il proteoma. Qui, abbiamo sviluppato un metodo per valutare l’omogeneità d’etichettatura attraverso il proteoma basato su un’analisi di formazione immagine di fluorescenza singola molecola. Nella nostra misura utilizzando un campione di cellule HeLa, la proporzione di proteine etichettate con almeno un colorante, che abbiamo chiamato ‘etichettatura occupazione’ (LO), è stato determinato per gamma dal 50% al 90%, sostenere l’elevato potenziale dell’applicazione di imaging di singola molecola di analisi del proteoma sensibile e precisa.
Introduction
Analisi del proteoma, che mira a quantificare l’intero set di molecole di proteina espressa nella cella, è un valido approccio negli attuali studi biologici e medicinali. Questa analisi si basa comunemente sulla spettrometria di massa, che individua le specie di proteine basato su spettri generati attraverso proteine ionizzazione1,2,3. Un metodo alternativo per analisi del proteoma è l’elettroforesi, tra cui l’elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGE), elettroforesi capillare ed elettroforesi bidimensionale (2D). Questo metodo si basa sull’etichettatura fluorescente non specifici di tutte le molecole di proteina in cellule analizzate, seguite da separazione elettroforetica e la individuazione e la quantificazione di ogni specie di proteina. Per ottenere il contrassegno richiesta non specifico proteina, una strategia è quella di utilizzare tinture fluorescenti che possono legarsi a proteine tramite interazioni elettrostatiche e idrofobiche, come blu di Coomassie e Sypro Ruby4,5,6 . Una strategia alternativa consiste nell’utilizzare etichettatura covalente con coloranti contenenti N-Idrossisuccinimide (NHS) estere o maleimide, che può legare covalentemente alle proteine attraverso comuni residui come primarie ammine e tioli, rispettivamente7, 8.
Nel frattempo, la sensibilità di rilevazione della fluorescenza è ideale per l’analisi di basso-abbondanza proteine e un piccolo numero di cellule. Formazione immagine di fluorescenza di singola molecola è uno dei metodi più sensibili che permette la rilevazione dei singoli coloranti fluorescenti e con etichetta delle proteine in vitro e in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Applicazione di questo metodo di imaging per analisi del proteoma basati su elettroforesi è previsto per consentire analisi altamente sensibili e quantitative contando singole proteine fluorescente etichettati. Tuttavia, rimane poco chiaro se etichettatura con coloranti fluorescenti è abbastanza omogenea in tutte le molecole di proteina, e come questa omogeneità è influenzata da specie differenti della proteina (Figura 1). Rilievi relativi alla soluzione semplice massa possono essere utilizzati per ottenere un rapporto molare di coloranti fluorescenti per proteine chiamate ‘efficienza di accoppiamento’8 o ‘etichettatura efficienza’, ma questa proprietà non fornisce informazioni sull’omogeneità di etichettatura tra molecole di proteina.
Qui, descriviamo il protocollo per un’analisi per indagare l’omogeneità d’etichettatura per tutte le specie di proteine nella cellula (Figura 2)16. I due passaggi chiavi di questo test sono imaging e purificazione della proteina. Nel primo passaggio, tutte le proteine nelle cellule fluorescente sono etichettate e biotinilato, quindi estratta separatamente utilizzando l’elettroforesi del gel seguita da electroelution. Nel secondo passaggio, proprietà di fluorescenza di molecole singole proteine nei campioni estratti vengono valutate in base su formazione immagine singola molecola. Da questi dati, parametri importanti per l’analisi di conteggio, come la percentuale di proteine etichettate con un’almeno una tingono, che noi chiamiamo etichettatura occupazione (LO)16, e il numero medio di coloranti fluorescenti legati ad una molecola singola proteina (n̄ colorante), può essere caratterizzato. Nel protocollo, una procedura ottimizzata per l’etichettatura del proteoma delle cellule HeLa con tintura di cianina 3 (Cy3) a base di estere NHS è presentata come esempio e può essere modificata con altre procedure di etichettatura secondo obiettivi di ricerca desiderato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive un protocollo per quantificare l’omogeneità d’etichettatura di ogni specie di proteina marcata nelle cellule dopo la separazione con SDS-PAGE (passaggio 3). Il metodo di separazione possa essere sostituito con altri metodi come la cromatografia liquida o elettroforesi capillare, che permettono la separazione e frazionamento delle proteine cellulari con alta risoluzione, mentre che richiedono attrezzature speciali23. Il metodo d’etichettatura utilizzando NHS-estere nel pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Masae Ohno e Kazuya Nishimura per consulenza e assistenza sperimentale. Questo lavoro è stato supportato da PRESTO (JPMJPR15F7), Japan Science and Technology Agency, localizzativi per giovani scienziati (A) (24687022), sfidando ricerca esplorativa (26650055) e ricerca scientifica in settori innovativi (23115005), Japan Society for la promozione della scienza e di sovvenzioni da parte della Takeda Science Foundation e la Fondazione Memorial Mochida per il medico e ricerca farmaceutica. S.L. riconosce sostegno dal programma RIKEN associare programma internazionale (IPA).
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg, Biomedical Image Processing. Computer. 16 (1), 22-34 (1983).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
