Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы
Summary
Пошаговая процедура описывается для безэтикетки иммобилизации экзосом и внеклеточных пузырьков из жидких образцов и их визуализации с помощью атомной силовой микроскопии (AFM). Изображения AFM используются для оценки размера пузырьков в растворе и характеризуют другие биофизические свойства.
Abstract
Экзосомы и другие внеклеточные пузырьки (EVs) представляют собой молекулярные комплексы, состоящие из липидной мембраны везикулы, ее поверхностного украшения мембранными белками и другими молекулами, а также разнообразное содержание светила, унаследованного от родительской клетки, которая включает РНК, белков и ДНЯ. Характеристика гидродинамических размеров ЭВ, которая зависит от размера везикулы и его коронарного слоя, образованного поверхностными украшениями, стала рутинной. Для экзосомы, самой маленькой из ЭВ, относительная разница между размерами гидродинамических и пузырьков значительна. Характеристика размеров пузырьков криогенной передачей электронной микроскопии (крио-TEM) изображения, золотой стандарт техники, остается проблемой из-за стоимости инструмента, опыт, необходимый для выполнения подготовки образца, изображений и анализа данных, и небольшое количество частиц часто наблюдается в изображениях. Широко доступной и доступной альтернативой является атомная микроскопия силы (AFM), которая может производить универсальные данные о трехмерной геометрии, размерах и других биофизических свойствах внеклеточных пузырьков. Разработанный протокол направляет пользователей в использовании этого аналитического инструмента и излагает рабочий процесс для анализа EVs AFM, который включает в себя подготовку образца для визуализации EVs в гидратированной или высохлой форме, электростатическая иммобилизация пузырьки на субстрате, сбор данных, его анализ и интерпретация. Репрезентативные результаты показывают, что фиксация ЭВ на модифицированной поверхности слюды предсказуема, настраивается и позволяет пользователю получить результаты размеров для большого количества пузырьков. Было установлено, что размер везикула, основанный на данных AFM, согласуется с крио-TEM-изображением.
Introduction
Внеклеточные пузырьки (Эпикулы) присутствуют во всех жидкостях организма, включая кровь, мочу, слюну, молоко и амниотическую жидкость. Экзосомы образуют районный класс EVs, отличаемый от других ЭВ эндосомальным биогенезом, маркерами эндосомного пути и наименьшим размером среди всех ЭВ. Размер экзосом часто сообщается с существенной изменчивостью между исследованиями. Результаты размеров были признаны зависимыми от метода, что отражает разницу в физических принципах, используемых различными аналитическими методами для оценки размеров EV1,2. Например, анализ отслеживания наночастиц (NTA) – наиболее широко используемый метод характеристики размеров – оценивает размер Овв как их гидродинамические диаметры, которые характеризуют устойчивость к броуновской мобильности ЭВ в растворе. Больший гидродинамический диаметр везикулы подразумевает его низкую подвижность в жидкости. Корональный слой вокруг пузырьков, состоящий из поверхностных белков и других молекул, прикрепленных или адсорбированных на поверхность мембраны, существенно препятствует подвижности и увеличивает гидродинамический размер ЭВ. В относительном выражении это увеличение особенно велико для экзосом3,как показано на рисунке 1.
Криогенная электронная микроскопия передачи (крио-TEM) изображение является окончательным методом в характеристике везикул размеров и морфологии в их гидратированных состояний. Тем не менее, высокая стоимость приборов и специализированные знания, необходимые для его правильного использования мотивировать изучение альтернативных методов, которые могут изображения гидратированных EVs. Еще одним заметным недостатком этой техники является относительно небольшое количество ЭВ, наблюдаемых или охарактеризованных в приобретенных крио-TEM-изображениях.
Атомная микроскопия силы (AFM) визуализирует трехмерную топографию гидратированных или высохших ЭВ4,5,6 путем сканирования зонда по субстрату, чтобы провести изображение частиц на поверхности. Основные шаги протокола для характеристики EVs aFM изложены в этом исследовании. Перед визуализацией пузырьков в жидкости, они должны быть обездвижены на субстрате либо привязывая к функционализированной поверхности, захватвая в фильтр, или электростатического притяжения7. Электростатическая фиксация на положительно заряженном субстрате является особенно удобным вариантом для иммобилизации экзосом, которые, как известно, обладают отрицательным потенциалом зеты. Однако те же электростатические силы, которые обездвиживают внеклеточные пузырьки на поверхности, также искажают их форму, что делает анализ данных после визуализации необходимым. Мы разрабатываем этот момент, описывая алгоритм, который оценивает размер шаровых пузырьков в решении на основе данных AFM о искаженной форме экзосомы, обездвиженных на поверхности.
В разработанном протоколе представлена процедура надежной электростатической иммобилизации пузырьков, за которой следуют шаги, необходимые для выполнения изображений атомной силы в гидратированных или высохлых состояниях. Выявлены факторы, влияющие на концентрацию обездвиженные пузырьки. Дано руководство о том, как выполнить электростатическую иммобилизацию образцов с различной концентрацией ЭВ в растворе. Обсуждается выбор экспериментальных условий, позволяющих оценить эмпирические вероятности распределения различных биофизических свойств на основе достаточно большого количества обездвиженных пузырьков. Приведены примеры пост-изображения данных AFM. В частности, описан алгоритм определения размера пузырьков в решении на основе характеристики AFM обездвиженых ЭВ. Репрезентативные результаты показывают последовательность размеров везикула aFM с результатами крио-TEM-изображения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Иммобилизация ЭВ из биологической жидкости, сканирование поверхности и анализ изображений являются основными шагами разработанного протокола для характеристики AFM ВВ в жидкости. Количество пузырьков поддается весы изображения AFM с изображением области поверхности и концентрации по?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают финансовую поддержку со стороны Национального научного фонда (номер премии IGERT-0903715), Университета штата и технологии (стипендий Сколтеха).
Materials
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
References
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
- Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
- Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
- Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
- Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
- Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
- Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
- Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
- Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
- Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
- Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
- Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
- Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
- Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
- Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
- Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
- Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
- van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).
