Estudio sobre el metabolismo de seis insecticidas sistémicos en un cultivo de suspensión celular recién establecido derivado del té (Camellia Sinensis L.) Hojas
Summary
Este trabajo presenta un protocolo para establecer un cultivo de suspensión celular derivado del té (Camellia sinensis L.) hojas que se pueden utilizar para estudiar el metabolismo de los compuestos externos que pueden ser tomados por toda la planta, como insecticidas.
Abstract
Se desarrolló una plataforma para estudiar el metabolismo de insecticidas utilizando tejidos in vitro de la planta de té. Las hojas de las plantas de té estéril fueron inducidas a formar callos sueltos en murashige y Skoog (MS) medios basales con las hormonas vegetales 2,4-ácido diclorofenoxacetico (2,4-D, 1,0 mg L-1) y kinetina (KT, 0,1 mg L-1). Callus se formó después de 3 o 4 rondas de subcultura, cada una con una duración de 28 días. El callo suelto (alrededor de 3 g) se inoculó en medios líquidos B5 que contenían las mismas hormonas vegetales y se cultivaba en una incubadora de temblores (120 rpm) en la oscuridad a 25 oC. Después de 3 x 4 subcultivos, se estableció una suspensión celular derivada de la hoja de té en una relación subcultal que oscila entre 1:1 y 1:2 (líquido madre de suspensión: medio fresco). Usando esta plataforma, se añadieron seis insecticidas (5 g de ml-1 cada tiametoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimetoato y omethoato) al cultivo de suspensión celular derivado de la hoja de té. El metabolismo de los insecticidas fue rastreado mediante cromatografía líquida y cromatografía de gases. Para validar la utilidad del cultivo de suspensión de células de té, los metabolitos de tiametoxano y dimetoato presentes en cultivos celulares tratados y plantas intactas se compararon utilizando espectrometría de masas. En los cultivos de células de té tratadas, se encontraron siete metabolitos de tiametoxano y dos metabolitos de dimetoato, mientras que en las plantas intactas tratadas, sólo se encontraron dos metabolitos de tiametoxam y uno de dimetoato. El uso de una suspensión celular simplificó el análisis metabólico en comparación con el uso de plantas de té intactas, especialmente para una matriz difícil como el té.
Introduction
El té es una de las bebidas no alcohólicas más consumidas en el mundo1,2. El té se produce a partir de las hojas y cogollos de la perley perenne Camellia sinensis L.Las plantas de té se cultivan en vastas plantaciones y son susceptibles a numerosas plagas de insectos 3,4. Los insecticidas organofosforados y neonicotinoides se utilizan a menudo como insecticidas sistémicos5 para proteger las plantas de té de plagas como las moscas blancas, las tolvas de hojas y algunas especies de lepidópteros6,7. Después de la aplicación, estos insecticidas son absorbidos o translocados en la planta. Dentro de la planta, estos insecticidas sistémicos pueden transformarse a través de hidrólisis, oxidación o reacciones de reducción por enzimas vegetales. Estos productos de transformación pueden ser más polares y menos tóxicos que los compuestos principales. Sin embargo, para algunos organofosfatos, las bioactividades de algunos productos son más altas. Por ejemplo, el acefato se metaboliza en el metamidofos más tóxico8,9, y el dimetoato en el omethoato10,11. Por lo tanto, los estudios metabólicos de las plantas son importantes para determinar el destino de un pesticida dentro de una planta12.
Se ha demostrado que los cultivos de tejidos vegetales son una plataforma útil para investigar el metabolismo de los plaguicidas, con los metabolitos identificados similares a los que se encuentran en las plantas intactas13,14,15. El uso de cultivos tisulares, particularmente cultivos de suspensión celular, tiene varias ventajas. En primer lugar, los experimentos pueden llevarse a cabo sin microorganismos, evitando así la interferencia de la transformación o degradación de plaguicidas por microbios. En segundo lugar, el cultivo de tejidos proporciona materiales consistentes para su uso en cualquier momento. En tercer lugar, los metabolitos son más fáciles de extraer de cultivos de tejidos que de plantas intactas, y los cultivos de tejidos a menudo tienen menos compuestos intercaladores y menor complejidad de los compuestos. Por último, los cultivos de tejidos se pueden utilizar más fácilmente para comparar una serie de metabolismo de pesticidas en un solo experimento16.
En este estudio, se estableció con éxito una suspensión celular derivada de las hojas de la planta de té cultivada estérilmente. El cultivo de suspensión de células de té se utilizó entonces para comparar los comportamientos de disipación de seis insecticidas sistémicos.
Este protocolo detallado está destinado a proporcionar alguna orientación para que los investigadores puedan establecer una plataforma de cultivo de tejido vegetal útil para estudiar el destino metabólico de los xenobióticos en el té.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo presenta el proceso detallado de establecer un modelo de metabolismo de pesticidas en el tejido vegetal del té, incluyendo la selección de explantas, la determinación de la viabilidad celular y el establecimiento de un cultivo de suspensión de células de té con alto nivel metabólico Actividad. Cualquier parte de un tejido vegetal podría utilizarse para iniciar el callo en un ambiente esterilizado25. Las hojas de té fueron elegidas para la iniciación del callo en este estud…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave (2016YFD0200900) de China, la Fundación Científica Natural Nacional de China (No 31772076 y No 31270728), China Postdoctoral Foundation (2018M630700) y Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Open Fund of Laboratorio Clave Estatal de Biología y Utilización de Plantas de Té (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
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