Formação de Material de Seda de Aranha Recombinante por Solvatação Aquosa Usando Calor e Pressão

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir soluções de proteína de seda de aranha recombinante solúvel em água e as formas materiais que podem ser formadas a partir dessas soluções.

Abstract

Muitas aranhas produzem sete tipos de sedas. Seis das sedas são fibra na forma quando produzidas pelas aranhas. Estas fibras não são solúveis em água. A fim reproduzir as propriedades mecânicas notáveis de sedas da aranha, devem ser produzidas em anfitriões heterólogo porque as aranhas são territoriais e Cannibalistic. Os análogos sintéticos da seda da aranha igualmente tendem a ser insolúveis em soluções aquosas. Assim, uma grande percentagem de investigação em sedas de aranha recombinante dependem de solventes orgânicos que são prejudiciais para a produção em grande escala de materiais. O método do nosso grupo força a solvação dessas sedas de aranha recombinante em água. Notavelmente, quando essas proteínas são preparadas usando este método de calor e pressão, uma ampla gama de formas materiais pode ser preparada a partir da mesma solução de proteínas de seda de aranha recombinante (rSSp), incluindo: filmes, fibras, esponja, hidrogel, lyogel, e adesivos. Este artigo demonstra a produção do rssp solvatados e dos formulários materiais em uma maneira que seja compreendida mais facilmente do que dos materiais e dos métodos escritos sozinho.

Introduction

As sedas de aranha ganhou o interesse de cientistas materiais para sua combinação impressionante de força, elasticidade, e biocompatibility. Recriando fibras tem sido tradicionalmente o impulso da pesquisa. Este esforço foi dificultado pela insolubilidade recombinante da proteína de seda da aranha (rssp) na água assim como a incapacidade de técnicas tradicionais do solvatação (agentes e detergentes de chaotropic) para conseguir o solvatação aquoso. Além disso, as técnicas que foram desenvolvidas para as versões de altamente fácil do rssp não trabalham em todas as variantes do rssp e também requerem manipulação substancial e tempo que muitas vezes resulta em perda de proteína^1,2. Isto conduziu pela maior parte no campo que utiliza 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) como um solvente de que para formar fibras, e outras formas materiais limitadas. A vantagem é que todos os rSSp conhecidos são solúveis em HFIP, proporcionando uniformidade de dados entre cada grupo de pesquisa. A desvantagem é que HFIP é um solvente tóxico que é caro e impraticável a escala devido a preocupações de saúde e considerações ambientais.

Uma aproximação nova à solvação do rssp foi desenvolvida que ponte a abertura tecnológica entre o solvente orgânico áspero hfip e as outras técnicas que trabalharam seletivamente para o solvatação do rssp. A combinação de aquece e de pressões específicos foi aplicada às suspensões do rssp e da água. Os resultados foram próximos de 100% de solvação e recuperação do rSSp, bem como altas concentrações protéicas; uma variedade de formas de materiais foi determinada para ser possível a partir dessas formulações que não eram todas realizáveis usando hfip ou outros solventes orgânicos^3,4,5,6. O objetivo desta abordagem é a solubilizar eficientemente e facilmente proteínas de aranha recombinante purificada e seca em uma solução aquosa que pode então ser utilizada para a produção de uma variedade de formas materiais.

Fibras, filmes, revestimentos, adesivos, hidrogéis, lyogels, microesferas e materiais de esponja são prontamente conseguíveis a partir da mesma solução aquosa de rSSp usando este método. A continuação da evolução deste método, não apenas com o rSSp adicional, mas com outras proteínas, pode levar a novas formas materiais e vias alternativas de purificação e solubilização de proteínas.

Protocol

1. preparação da mistura de seda da aranha de recombinação dos estoques liofilizados da proteína Determine a formulação e o volume necessários para as formações materiais pretendidas. As formulações típicas variam de 3% (w/v) até 15% (w/v). Usando essa seleção, calcule o rSSp, as concentrações e as proporções apropriadas. Utilizar as seguintes formulações para preparar cada material descrito neste protocolo: hidrogéis/esponjas/lyogels, 6% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; filmes/revestime…

Representative Results

A partir do método descrito de solubilização do rSSp, uma variedade de formas materiais pode ser alcançada como observado na Figura 1. O método de solubilização é aplicar calor e pressão, gerados por um microondas convencional, a uma suspensão de rSSp e água. Quando as temperaturas e as pressões críticas são alcançadas, a proteína solubilize. A partir desta solução de rSSp solubilizada, são apresentadas as condições necessárias para sete…

Discussion

Depois que as proteínas de seda da aranha de recombinação são purified têm que então ser preparadas em uma solução que possa ser usada para a formação material. Misturando a proteína de seda da aranha liofilizada com água e expondo esta mistura à irradiação da microonda, para gerar o calor e a pressão, é possível preparar uma solução do rSSp. Uma grande variedade de formas materiais pode ser produzida a partir deste método simples e eficiente de solubilização de rSSp. Cada material tem que ser prep…

Materials

3 mL Syringe with Luer-Lok Tip	BD	309657	Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225142	Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225144	Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade	Pharmco-Aaper	231000099
Freezone 4.5 Plus	Labconco	7386030	Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)	IDEX	P-629
Microwave	Magic Chef	HMD1110B	120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD	IDEX	F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID	IDEX	1531B
Sprayer: Master Airbrush	Master Airbrush	TC-60