Met en gezichts immunofluorescentie kleuring om vasculaire endotheel cellen direct te observeren
Summary
Hier presenteren we een protocol voor immunofluorescentie kleuring om de endotheliale cellen van de muis aorta direct te observeren. Deze techniek is nuttig bij het bestuderen van het cellulaire en moleculaire fenotype van endotheel cellen in verschillende stromingspatronen en in de ontwikkeling van atherosclerose.
Abstract
Afwijkende veranderingen in endotheliale fenotype en morfologie worden beschouwd als initiële gebeurtenissen in de pathogenese van atherosclerose. Directe observatie van het intacte endotheel zal waardevolle informatie bieden voor het begrijpen van de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen in de dysfunctionele endotheel cellen. Hier beschrijven we een gemodificeerde en gezicht immunofluorescentie kleuringstechniek die wetenschappers in staat stelt om duidelijke beelden van het intact endotheliale oppervlak te verkrijgen en de molecuul expressie patronen in situ te analyseren. De methode is eenvoudig en betrouwbaar voor het observeren van de gehele endotheliale monolaag op verschillende locaties van de aorta. Deze techniek kan een veelbelovend instrument zijn voor het begrijpen van de pathofysiologie van atherosclerose, vooral in een vroeg stadium.
Introduction
De vroege veranderingen in de vasculatuur beginnen voornamelijk in het endotheel, dat fungeert als een selectieve barrière tussen het bloed en de wand van het vat met zijn intercellulaire strakke junctieve complexen1. Substantieel bewijs wijst op een cruciale rol voor de mechanische effecten van de bloedstroom in modulerende endotheliale functie2. Vloeibare shear stress, een wrijvingskracht gegenereerd door de doorbloeding, differentieel vormen endotheliale celmorfologie en functie, afhankelijk van de specifieke stroom paradigma’s op verschillende vasculaire locaties2,3. Atherosclerotische laesies komen bij voorkeur op plaatsen van verstoorde bloedstroom (d-flow), zoals krommingen van het vat, stroom afscheiders en vertakkingspunten, in vergelijking met regio’s van steady flow (s-flow), zoals het rechte segment van de slagader. Daarom moet directe observatie van endotheliale morfologie en molecuul expressie patronen belangrijke inzichten geven in de structurele en functionele fenotypes van endotheliale cellen in verschillende stromings paradigma’s.
Gekweekte endotheelcellen mogen het eigenlijke fenotype niet uitdrukken zoals in vivo, deels als gevolg van het verlies van de impact van vloeibare shear stress, omringende cytokines en celcelcellen of celextracellulaire matrix interacties. Om dit te helpen, kan de intacte endotheliale celmonolayer worden bestudeerd op dwarsdoorsneden met behulp van klassieke immunohistochemie. Echter, de endotheliale monolaag is zo dun en kwetsbaar dat het meestal niet duidelijk kan worden waargenomen. En face immunohistochemie is gebruikt om het inwendige oppervlak van het endotheel te observeren, maar is gecompliceerd of onregelmatig in de resultaten omdat het endotheel gemakkelijk uit het onderliggende weefsel kan worden ontdaan, of slechts een deel van de arteriële wand van ratten of konijnen, waarvan de wanden dik zijn, is4,5gemonteerd.
Muismodellen hebben in veel opzichten aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere dieren. Hier gebruiken we een gemodificeerde en gezicht immunofluorescentie techniek om endotheliale cellen van de aortaboog en thoracale aortin C57BL/6 muis te analyseren. Een dergelijke techniek is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de endotheliale pathofysiologie in verschillende stromingspatronen en in de ontwikkeling van atherosclerose6,7,8,9,10. Deze methode stelt wetenschappers in staat om het hele oppervlak van het endotheel duidelijk te observeren en om de expressie patronen van een gegeven eiwit te vergelijken in gebieden onder verschillende vocht afschuiving stress.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het endotheel wordt blootgesteld aan talrijke proatherogene factoren, waaronder lipiden, ontstekingsmediatoren en vloeibare shear stress1,11,12. Directe observatie van endotheelcellen in situ biedt de speciale voordelen voor het analyseren van veranderingen in celmorfologie, intercellulaire kruispunten en molecuul expressie patronen in reactie op de letsel stimuli.
Eerdere studies hebben twee verschil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door de National Natural Science Foundation van China (Grant No. 81670451, 81770430), het Shanghai Rising-Star-programma (Grant No. 17QA1403000) en het Science Technology Committee van de gemeentelijke overheid van Shanghai (Grant No. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
