Identificando os produtores de aminoácidos com marcadores ricos em Codon raros
Summary
Este estudo apresenta uma estratégia alternativa para o método convencional de base analógica tóxica na identificação de superprodutores de aminoácidos usando marcadores raros-Codon-ricos para alcançar precisão, sensibilidade e alta taxa de transferência simultaneamente.
Abstract
Para satisfazer o mercado cada vez maior de aminoácidos, são necessárias cepas de produção de alto desempenho. Os produtores de aminoácidos são identificados convencionalmente, aproveitando as competições entre os aminoácidos e seus análogos. Entretanto, este método analógico-baseado é da baixa exatidão, e os análogos apropriados para ácidos aminados específicos são limitados. Aqui, apresentamos uma estratégia alternativa que possibilita uma triagem precisa, sensível e de alta produtividade de produtores de aminoácidos que usam marcadores raros e ricos em Codon. Esta estratégia é inspirada pelo fenômeno do viés de uso de Codon na tradução de proteínas, para o qual os códons são categorizados em comum ou raros com base em suas freqüências de ocorrência no DNA de codificação. A tradução de raros códons depende de suas RNAs de transferência raras correspondentes (tRNAs), que não podem ser totalmente carregadas pelos aminoácidos cognatos a fome. Teoricamente, os raros tRNAs podem ser cobrados se houver um excedente dos aminoácidos após o carregamento dos isoaceptores comuns sinônimos. Conseqüentemente, as traduções causadas por códons raros podiam ser restauradas alimentando ou superproduçoes intracelular dos aminoácidos correspondentes. esta suposição, um sistema de seleção ou triagem para a identificação de superprodutores de aminoácidos é estabelecido através da substituição dos códons comuns dos aminoácidos alvo com suas alternativas raras sinônimos nos genes de resistência a antibióticos ou os genes codificando proteínas fluorescentes ou cromogênicas. Nós mostramos que as expressões da proteína podem extremamente ser impedidas pela incorporação de códons raros e que os níveis de proteínas correlacionam positivamente com as concentrações do ácido aminado. Usando este sistema, superprodutores de múltiplos aminoácidos podem ser prontamente selecionados a partir de bibliotecas de mutação. Esta estratégia rara-baseada em Codon exige somente um único gene modificado, e o anfitrião é menos provável escapar da seleção do que em outros métodos. Ele oferece uma abordagem alternativa para a obtenção de superprodutores de aminoácidos.
Introduction
A produção atual de aminoácidos depende muito da fermentação. No entanto, os títulos e rendimentos para a maioria das cepas de produção de aminoácidos estão abaixo das demandas crescentes do mercado global de aminoácidos que vale bilhões de dólares1,2. A obtenção de superprodutores de aminoácidos de alto desempenho é fundamental para a atualização da indústria de aminoácidos.
Estratégia tradicional para identificar produtores de aminoácidos explora as competições entre os aminoácidos e seus análogos na síntese protéica3,4. Estes análogos são capazes de carregar os tRNAs que reconhecem os aminoácidos correspondentes e, assim, inibir os alongamentos das cadeias peptídicas, levando ao crescimento preso ou morte celular5. Uma maneira de resistir às tensões analógicas é aumentar as concentrações de aminoácidos intracelulares. Os aminoácidos enriquecidos irão superar os análogos para os tRNAs finitos e garantir a correta síntese de proteínas funcionais. Conseqüentemente, as tensões que sobrevivem aos análogos podem ser selecionadas e são prováveis os overprodutores dos aminoácidos correspondentes.
Embora tenha sido bem sucedido na seleção de superprodutores de aminoácidos como L-leucina6, a estratégia baseada em analógico sofre de inconvenientes graves. Uma grande preocupação é a resistência analógica originada do processo de mutagenese ou através de mutações espontâneas. As cepas com resistência podem escapar da seleção bloqueando, exportando ou degradando os análogos5. Outra preocupação é os efeitos colaterais tóxicos dos análogos em outros processos celulares7. Como consequência, as cepas que sobrevivem à seleção analógica podem não ser os superprodutores de aminoácidos, enquanto os superprodutores desejados podem ser falsamente exterminados devido aos efeitos colaterais negativos.
Aqui, uma nova estratégia baseada na lei do viés de Codon é apresentada a fim de obter identificações precisas e rápidas de produtores de aminoácidos. A maioria de ácidos aminados são codificados por mais de um Triplet do nucleotide que seja favorecido diferentemente pelos organismos do anfitrião8,9. Alguns códons raramente são usados nas sequências de codificação e são referidos como os raros códons. Suas traduções em aminoácidos dependem dos tRNAs cognatos que carregam os aminoácidos correspondentes. Entretanto, os tRNAs que reconhecem os códons raros têm geralmente muito mais baixas abundâncias do que os tRNAs dos códons comuns10,11. Conseqüentemente, estes tRNAs raros são menos prováveis capturar os ácidos aminados livres nas competições com outros isoacceptors, e as traduções das seqüências raro-Codon-ricas começam a desacelerar ou mesmo são terminadas quando as quantidades de ácidos aminados são limitadas 10. as traduções poderiam, teoricamente, ser restauradas se houver um excedente de aminoácidos após o carregamento dos sinónimo comuns de tRNAs devido a superproduções ou a alimentações extras dos aminoácidos correspondentes12. Se o gene raro-Codon-rico codifica um marcador de seleção ou de triagem, as cepas que exibem os fenótipos correspondentes podem ser prontamente identificadas e são prováveis os superprodutores dos aminoácidos alvo.
A estratégia acima é aplicada para estabelecer uma seleção e um sistema de triagem para a identificação de superprodutores de aminoácidos. O sistema de seleção usa genes de resistência a antibióticos (por exemplo, KanR) como marcadores enquanto o sistema de triagem usa os genes que codificam as proteínas fluorescentes (por exemplo, proteína verde fluorescente [GFP]) ou cromogênica (por exemplo, prancerpurple). Os genes do marcador em ambos os sistemas são modificados substituindo números definidos dos códons comuns para o aminoácido alvejado com sua alternativa rara sinônimo. As tensões na biblioteca da mutação que abrigam o gene raro-Codon-rico do marcador são selecionadas ou examinadas circunstâncias apropriadas, e os overprodutores dos aminoácidos alvejados podem prontamente ser identificados. O fluxo de trabalho começa com a construção do raro-Codon-rico sistema de genes marcador, seguido pela otimização das condições de trabalho, e, em seguida, a identificação e verificação do aminoácido superprodutores. Esta estratégia analógico-independente é baseada no dogma na tradução da proteína e foi verificada praticamente para permitir identificações exatas e rápidas de overprodutores do ácido aminado. Teoricamente, poderia ser diretamente empregado para aminoácidos com códons raros e para todos os microrganismos. Ao todo, a estratégia rara-baseada em Codon servirá como uma alternativa eficiente à abordagem analógica convencional, quando análogos adequados para aminoácidos específicos não estão disponíveis, ou quando uma alta taxa de falsos positivos é a maior preocupação. O protocolo abaixo usa o Codon raro da leucina para demonstrar esta estratégia em identificar os superprodutores de Escherichia coli L-leucina.
Protocol
Representative Results
Discussion
O número de códons raros nos genes do marcador e o meio de seleção ou de triagem são críticos para inibir as expressões protéicas dos genes marcadores raros-Codon-modificados. Se não for detectada diferença significativa entre as expressões protéicas dos genes marcadores do tipo selvagem e seus derivados, aumentar o número de códons raros ou usar um meio limitado de nutrientes pode amplificar as diferenças. No entanto, se o efeito de inibição é muito forte, as expressões de proteínas não podem ser re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado conjuntamente pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 21676026), a chave nacional R & D programa da China (Grant no. 2017YFD0201400), e da China pós-doutorado Science Foundation (Grant no. 2017M620643). Obras no Instituto de avanço da UCLA (Suzhou) foram apoiadas pelas subvenções internas da província de Jiangsu e parque industrial de Suzhou.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
References
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