Differentiatie capaciteit van menselijke aorta gerelateerde adipeus voorlopercellen
Summary
Het doel van dit protocol is voor het testen van de mogelijkheid van voorlopercellen afgeleid van menselijke gerelateerde adipeus weefsel te differentiëren in meerdere cel geslachten. Differentiatie werd vergeleken met mesenchymale stamcellen, afgeleid van menselijke beenmerg, waarvan bekend is dat het differentiëren in adipocyte, Osteocyt en chondrocyten geslachten.
Abstract
Vetweefsel is een rijke bron van multi potente mesenchymale stamcellen (MSC) kunnen differentiëren in osteogenic, adipogenic, en chondrogenic geslachten. Adipogenic differentiatie van voorlopercellen is een belangrijk mechanisme rijden adipeus weefsel expansie en dysfunctie in reactie op obesitas. Begrip wijzigingen in gerelateerde adipeus weefsel (PVAT) is dan ook klinisch relevante in stofwisselingsziekte. Eerdere studies is echter voornamelijk uitgevoerd in de muis en andere dierlijke modellen. Dit protocol maakt gebruik van menselijke thoracale PVAT monsters verzameld van patiënten die een coronaire bypassoperatie graft. Adipeus weefsel van de oplopende aorta werd verzameld en gebruikt voor uitname van de stromale vasculaire breuk. Wij eerder bevestigde de aanwezigheid van obesitas voorlopercellen in menselijke PVAT met de capaciteit om te differentiëren in lipide-bevattende adipocytes. In deze studie, we verder geanalyseerd het potentieel van de differentiatie van cellen uit de stromale vasculaire, vermoedelijk met multi potente voorlopercellen. We vergeleken de PVAT-afgeleide cellen aan menselijke beenmerg MSC voor differentiatie in adipogenic, osteogenic, en chondrogenic geslachten. Na 14 dagen van differentiatie, specifieke vlekken werden gebruikt om het detecteren van accumulatie van lipide in adipocytes (rode olie O), calcific deposito’s in osteogenic cellen (Alizarine rood), of glycosaminoglycanen en collageen in chondrogenic cellen (Masson van Trichrome). Terwijl het beenmerg MSC efficiënt gedifferentieerd in alle drie geslachten, PVAT-afgeleide cellen had adipogenic en chondrogenic potentiële, maar miste robuuste osteogenic potentieel.
Introduction
Vetweefsel is een rijke bron van multi potente mesenchymale stamcellen (MSC) kunnen differentiëren in osteogenic, adipogenic, en chondrogenic lineages1. Dit weefsel wordt vergroot door hypertrofie van volwassen adipocytes en de novo differentiatie van resident MSC naar adipocytes. Gerelateerde adipeus weefsel (PVAT) rondom bloedvaten en regelt vasculaire functie2,3. Obesitas-geïnduceerde PVAT uitbreiding verergert cardiovasculaire aandoeningen. Terwijl het multipotente potentieel van MSC van menselijke subcutane obesitas depots zijn goed bestudeerde4,5, geen studies hebben transplanteren en geëvalueerd van de capaciteit van de differentiatie van menselijke PVAT afkomstige voorlopercellen, waarschijnlijk wegens de invasiviteit van overheidsopdrachten. Dus, het doel van dit werk is bedoeld als een methode explant en propageren van voorlopercellen van menselijke aorta PVAT van patiënten met hart-en vaatziekten en het testen van hun neiging om te differentiëren tot osteogenic, chondrogenic en adipogenic geslachten. Onze bron van PVAT is op de website van wapendrager van de rondweg prothese op Oplopend aorta van zwaarlijvige patiënten die een coronaire bypassoperatie graft. Vers-geïsoleerde PVAT is enzymatisch losgekoppeld en de stromale vasculaire breuk is geïsoleerd en gekweekt in vitro, zodat we kunnen testen voor de eerste keer de capaciteit van de differentiatie van menselijke PVAT afkomstige voorlopercellen.
Met behulp van primaire gekweekte menselijke PVAT stromale vasculaire breuk, we drie tests ontworpen voor het opwekken van de stam/voorlopercellen om te differentiëren naar adipogenic, osteogenic, of chondrogenic lineages getest. Onze voorafgaande studie is gebleken dat een bevolking van CD73 +, CD105 +, en PDGFRa + (CD140a) cellen die krachtig in adipocytes6 differentiëren kunnen, hoewel hun multipotent werd niet getest. PVAT regelt rechtstreeks vasculaire Toon en ontsteking7. De grondgedachte voor het testen van het potentieel van de differentiatie van deze roman celpopulatie is om te beginnen te begrijpen van de gespecialiseerde invloed van PVAT op vasculaire functie, en mechanismen van PVAT expansie tijdens obesitas. Deze methode verbetert ons begrip van de functies van vetweefsel afgeleide voorlopercellen en laat ons toe om te identificeren en vergelijken van de overeenkomsten en verschillen van voorlopercellen uit verschillende weefsel bronnen. Wij bouwen op gevestigde en gevalideerde methoden voor het isoleren en differentiatie van MSC naar verschillende geslachten en optimaliseren van procedures voor het maximaliseren van de levensvatbaarheid van menselijke PVAT afkomstige voorlopercellen. Deze technieken hebben brede toepassingen op het gebied van stuurpen en progenitor cel onderzoek en adipeus weefsel ontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obesitas voorlopercellen van verschillende depots verschillen in fenotype en differentiatie potentiële9. Kweken van PVAT afkomstige progenitoren uit een enkele patiënt donor in gelijktijdige inductie neer drie verschillende geslachten, zorgt adipogenic, osteogenic, en chondrogenic, voor een goed gecontroleerd onderzoek van de pluripotente capaciteit van deze roman bevolking van voorlopercellen. De in dit verslag beschreven methodologie kan worden gebruikt voor het testen van de capaciteit van de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen de hulp van onderzoek navigatie in Maine Medical Center voor het helpen met het verkrijgen van klinische weefsel, en de histopathologie en Histomorphometry Core (ondersteund door 1P20GM121301, L. Liaw PI) bij Maine Medical Center Research Instituut voor segmenteren en kleuring. Dit werk werd gesteund door de NIH verlenen R01 HL141149 (L. Liaw).
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
References
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
- Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
- de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
- Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
- Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
- Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
- Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
