Valutazione di una reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa nidificata universale per la rilevazione di Lyssaviruses
Summary
È stata sviluppata una reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa nidificata di Pan-Lyssavirus per rilevare in modo specifico tutti i Lyssaviruses conosciuti. La validazione utilizzando campioni di cervello di rabbia di diverse specie animali ha mostrato che questo metodo ha una sensibilità e una specificità equivalenti al test anticorpale fluorescente standard oro e potrebbe essere utilizzato per la diagnosi di rabbia di routine.
Abstract
Per rilevare il virus della rabbia e altre specie membro del genere Lyssavirus all’interno della famiglia Rhabdoviridae, la reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa di Pan-Lyssavirus (RT-PCR nidificata) è stata sviluppata per rilevare la regione conservata del gene nucleoproteico (N) di Lyssaviruses. Il metodo applica la trascrizione inversa (RT) utilizzando RNA virale come modello e oligo (dT)15 e esameri casuali come primer per sintetizzare il DNA complementare virale (cDNA). Quindi, il cDNA virale viene utilizzato come modello per amplificare un frammento di gene 845 BP N nella PCR del primo round utilizzando primer esterni, seguiti da PCR nidificata del secondo round per amplificare il frammento finale 371 BP utilizzando primer interni. Questo metodo può rilevare diverse cladi genetiche di virus della rabbia (RABV). La validazione, utilizzando 9.624 campioni cerebrali di otto specie animali domestiche in 10 anni di diagnosi di rabbia clinica e di sorveglianza in Cina, ha mostrato che il metodo ha 100% di sensibilità e 99,97% di specificità rispetto alla fluorescenza diretta test anticorpale (FAT), il metodo standard Gold raccomandato dall’organizzazione mondiale della sanità (OMS) e dall’organizzazione mondiale per la salute animale (OIE). Inoltre, il metodo potrebbe anche amplificare in modo specifico il frammento di gene N mirato di 15 altre specie di Lyssavirus approvate e due nuove nel 10 ° rapporto del Comitato internazionale sulla tassonomia dei virus (ICTV) come valutato da un rilevamento mimico di sintetizzato N plasmidi genici di tutti i Lyssaviruses. Il metodo fornisce una comoda alternativa al FAT per la diagnosi della rabbia ed è stato approvato come standard nazionale (GB/T36789-2018) della Cina.
Introduction
La rabbia è una malattia zoonotica a livello mondiale causata da virus all’interno del genere Lyssavirus1. I Lyssaviruses (famiglia Rhabdoviridae) sono virus RNA a singolo-negativo-filamento con un genoma di circa 12 KB che codifica cinque proteine: N, fosfoproteina (P), proteina di matrice (M), glicoproteina (G), e la grande proteina o polimerasi (L). Sulla base delle sequenze nucleotidiche del gene N, della distanza genetica e dei modelli antigenici, i Lyssavirus sono stati suddivisi in 16 specie, comprendenti il virus della rabbia classica (RABV) e i virus correlati alla rabbia (RRV): virus bat di Lagos (LBV), Virus Duvenhage (DUVV ), Il Virus Mokola (MOKV), il bat europeo Lyssavirus 1 (EBLV-1), l’European bat Lyssavirus 2 (EBLV-2), bat lyssavirus australiano (ABLV), virus Aravan (ARAV), virus Ikoma (IKOV), Bokeloh bat Lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat Lyssavirus (GBLV), virus Irkut (IRKV), Virus Khujand (KHUV), virus della bat caucasica occidentale (WCBV), virus bat Shimoni (SHIBV) e Lleida bat Lyssavirus (LLEBV)2. Recentemente, sono stati identificati altri due Lyssavirus: Kotalahti bat Lyssavirus (KBLV) isolato da una mazza di Brandt (Myotis Brandtii) in Finlandia nel 20173 e Taiwan bat Lyssavirus (twblv) isolato da un pipistrello giapponese ( Pipistrellus Abramus) a Taiwan, Cina nel 2016 – 20174.
Tutti i mammiferi sono suscettibili alla rabbia; Tuttavia, nessuna lesione patognomonica lorda o segni clinici specifici ne consentono l’identificazione, e la diagnosi può essere fatta solo nel laboratorio5. Il metodo più diffuso per la diagnosi della rabbia è il grasso, che è considerato come il gold standard sia dall’OMS che dall’OIE5,6. Tuttavia, il FAT può produrre risultati inaffidabili su campioni di tessuto cerebrale degradato/autolizzato. Inoltre, non può essere utilizzato per il dosaggio di campioni di fluidi biologici come il liquido cerebrospinale (CSF), la saliva e l’urina, precludendo in gran parte il suo impiego nella diagnosi prima della morte7. Test diagnostici convenzionali alternativi, come il test di infezione della coltura del tessuto della rabbia (RTCIT) e il test di inoculo del topo (MIT), richiedono diversi giorni6, un grave inconveniente quando è essenziale una diagnosi rapida.
Vari test diagnostici molecolari (ad esempio, la rilevazione di RNA virale da RT-PCR, il saggio immunosorbente PCR-Linked [PCR-ELISA], l’ibridazione in situ e la PCR in tempo reale) sono utilizzati come tecniche rapide e sensibili per la diagnosi della rabbia8. La RT-PCR è ora raccomandata dall’OIE per la diagnosi della rabbia di routine e una PCR heminested (HN) è descritta nel manuale dell’OIE di test diagnostici e vaccini per animali terrestri per rilevare tutti i Lyssavirus5. Qui descriviamo un pan-Lyssavirus annidato RT-PCR, che consente il rilevamento specifico e sensibile di tutte le 18 specie di Lyssavirus paragonabile o superiore a quella ottenuta dal FAT. Il principio del metodo è una RT dell’RNA bersaglio (regione conservata del gene Lyssavirus N) in cDNA, seguita dall’amplificazione del cDNA da due cicli di PCR. Il cDNA subisce la PCR del primo round con primer esterni per amplificare un frammento di 845 BP; quindi, la PCR di secondo ciclo utilizza il prodotto PCR al primo round come modello per amplificare un frammento di 371 BP con primer interni. I due cicli di PCR aumentano significativamente la sensibilità del saggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Attualmente, RABV è un importante Lyssavirus responsabile di quasi tutte le rabbia umana e animale in Cina, così come in altri paesi. Inoltre, una variante IRKV è stata identificata per la prima volta da un pipistrello Murina leucogaster nella provincia di Jilin nella cina nordorientale nel 201210, ed è stato segnalato per causare la morte di un cane nella provincia di Liaoning nel 201711. Più recentemente, un romanzo Lyssavirus, TWBLV, è stato anche…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto dal piano nazionale di ricerca e sviluppo chiave (Grant No. 2016YFD0500401) e dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant n. 31302043).
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
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