Estratégias não invasivas para manipulação crônica da atividade neuronal controlada por DREADD
Summary
Aqui nós descrevemos dois métodos não-invasores para controlar cronicamente a atividade neuronal usando a quimiogenética nos ratos. Os Eye-gotas foram usados para entregar o Clozapine-N-óxido (CNO) diário. Nós igualmente descrevemos dois métodos para a Administração prolongada de CNO na água bebendo. Estas estratégias para o controle neuronal crônico exigem a intervenção mínima que reduz o stress dos animais.
Abstract
Estratégias quimiogenéticas surgiram como ferramentas confiáveis para o controle remoto da atividade neuronal. Entre estes, os receptores do desenhador ativados exclusivamente por drogas do desenhador (DREADDs) tornaram-se a aproximação chemogenetic a mais popular usada na neurociência moderna. A maioria de estudos entregam o ligante Clozapine-N-óxido (CNO) usando uma única injeção intraperitoneal, que seja apropriada para a ativação/inibição aguda da população neuronal alvejada. Há, no entanto, apenas alguns exemplos de estratégias para a modulação crônica de neurônios controlados por DREADD, a maioria dos quais dependem do uso de sistemas de parto que necessitam de intervenção cirúrgica. Aqui, nós expandimos em duas estratégias não invasoras para entregar o ligante CNO para manipular cronicamente a população neural nos ratos. O CNO foi administrado por meio de gotas oculares repetitivas (diárias), ou cronicamente através da água potável do animal. Estes paradigmas não invasivos resultam em uma ativação robusta dos receptores de designers que persistiram ao longo dos tratamentos CNO. Os métodos descritos aqui oferecem alternativas para o controle crônico de atividade neuronal de DREADD-negociado e podem ser úteis para experimentos projetados para avaliar o comportamento em animais em movimento livre, com foco em métodos de entrega de CNO menos invasivos.
Introduction
Os avanços técnicos no campo da neurociência permitiram aos cientistas identificar e controlar com precisão a atividade de populações neuronais particulares1. Isso contribuiu para melhor compreender a base dos circuitos neuronais e seu impacto no comportamento animal, bem como, revisando dogmas estabelecidos2,3. Entre essas novas ferramentas, as estratégias optogenéticas e quimiogenéticas tiveram um impacto profundo não só na qualidade das descobertas, mas também na forma como os experimentos são concebidos e projetados4. No presente manuscrito, focamos em estratégias quimiogenéticas para o controle da ativação de neurônios por meio de estratégias de receptores-ligantes projetados. Os receptores do desenhador ativados exclusivamente por drogas do desenhador (DREADDs) representam uma das ferramentas chemogenetic as mais populares para o controle remoto da atividade neuronal, como revisto por Roth 20165. DREADDs utilizam receptores de acetilcolina muscarínicos modificados que são especificamente ativados por um ligand inerte, Clozapine-N-óxido (CNO)6.
A maioria dos estudos utiliza o CNO administrado por injeções intraperitoneal (i.p.), que efetivamente controla a dosagem e o tempo de ativação de receptores projetados de forma aguda. No entanto, quando a ativação de DREADD repetitiva ou crônica é necessária, o uso de múltiplas injeções i.p. se torna inviável. Para abordar esse problema, foram relatadas diferentes estratégias para o parto crônico de CNO, incluindo os minipumps implantados7 e as cânulas intracranianas8,9. Para diferentes extensões, todas essas estratégias causam o estresse e a dor dos animais10, e necessitam de uma intervenção cirúrgica que também possa ter um impacto direto nas respostas comportamentais a serem testadas11. Aqui, nós descrevemos três estratégias não invasoras para a entrega crônica de CNO.
Para esta finalidade, os ratos foram injetados estereotaxicamente no hipocampo com um vírus adeno-associado (AAV) que codifica uma versão projetada do receptor muscarínicos do excitatórios m3 (hM3Dq) que quando ativado pelo ligante CNO conduz à explosão-como o acendimento de neurônios6. Mostrou-se anteriormente que um único olho-gota contendo CNO pode efetivamente provocar uma ativação robusta de DREADD-expressando neurônios12. Aqui nós descrevemos um método modificado para a entrega repetitiva de gotas de olho. Para alcançar o controle crônico e sustentado dos receptores do desenhador, nós descrevemos em seguida uma estratégia não invasora para entregar CNO aos ratos através da água bebendo. Finalmente, nós descrevemos um paradigma alternativo para entregar CNO na água bebendo durante uma janela restrita do tempo. A atividade locomotora de camundongos, bem como o comportamento de beber e o consumo de soluções calórica doces, são, na sua maioria, restritas à porção escura do ciclo claro/escuro13,14. Por isso, adotou-se um protocolo baseado na preferência do camundongo pela sacarose. Medindo a indução do gene imediato-cedo c-fos em pilhas AAV-infectadas, como um leitura para a ativação neuronal12,15, nós encontramos que estas estratégias da entrega de CNO robustamente ativam neurônios dreadd-controlados sobre prolongado Durações.
Protocol
Representative Results
Discussion
DREADDs surgiram como uma abordagem popular e eficaz para manipular remotamente a atividade neuronal17. O projeto de estratégias alternativas para a entrega CNO aumentará amplamente o espectro de opções disponíveis para configurações experimentais específicas. Além disso, estratégias não invasivas para a entrega da CNO minimizam qualquer potencial interpretação errónea dos resultados, reduzindo os efeitos colaterais adversos que podem impactar diretamente a saúde do animal. Aqui, n?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo programa de pesquisa intramural do Instituto Nacional de saúde mental (ZIA MH002964-02). Gostaríamos de agradecer o apoio do núcleo comportamental de roedores NIMH IRP (ZIC MH002952).
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
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