一种新型锥形海绵尖电极在幼虫斑马鱼中的电录记录

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 简化测量光诱发视网膜图像反应从幼虫斑马鱼。一种新型锥形海绵尖电极可以使利用电视图 erg 更容易地实现幼虫斑马鱼的视觉发育, 结果可靠, 成本更低。

Abstract

斑马鱼 (dadio rerio)通常用作发育研究中的脊椎动物模型, 特别适用于视觉神经科学。对于视觉性能的功能测量, 电像 (ERG) 是一种理想的非侵入性方法, 在高等脊椎动物物种中已经很好地确立了这一方法。这种方法正越来越多地用于检查斑马鱼的视觉功能, 包括在早期发育幼虫阶段。然而, 迄今为止, 幼虫斑马鱼 ERG 最常用的记录电极是玻璃微移液器电极, 这需要专门的制造设备, 这对资源有限的实验室提出了挑战。在这里, 我们提出了一个幼虫斑马鱼 ERG 协议使用锥形海绵尖端电极。与玻璃微移液器相比, 新型电极更容易制造和处理, 更经济, 也更不容易损坏幼虫的眼睛。与先前发布的 ERG 方法一样, 目前的协议可以通过光感受器和双极细胞响应————————————————————————————-该协议可以清楚地说明斑马鱼幼虫在整个早期发育过程中视觉功能的完善, 支持新型电极的实用性、灵敏度和可靠性。简化的电极是特别有用的, 当建立一个新的 ERG 系统或修改现有的小动物 ERG 设备的斑马鱼测量, 帮助研究人员在视觉神经科学使用斑马鱼模型生物。

Introduction

斑马鱼 (Daio rerio)已成为一种广泛使用的遗传脊椎动物模型, 包括视觉神经科学的研究。这种物种越来越受欢迎, 这是因为遗传操作容易、高度保守的脊椎动物视觉系统 (神经元类型、解剖形态和组织以及潜在的遗传学)、高繁殖力等。与哺乳动物模式¹相比, 畜牧业成本较低。非侵入性视网膜图 (erg) 长期以来一直被用于临床评估人类的视觉功能, 并在实验室环境中量化一系列大小物种的视力, 包括啮齿类动物和幼虫斑马鱼^{2,3,4 个,5}. 最常分析的 erg 成分是 a 波和 b 波, 分别来自感光感受器和双极神经元间。在幼虫斑马鱼中, 通过受精后 3天 (dpf) 建立视网膜的不同层, 光感受器锥形末端突触的形态在 4 dpf^6,7之前成熟。因此, 幼虫斑马鱼的视网膜外功能建立在 4 dpf 之前, 这意味着 ERG 是可测量的, 从这个早期开始。由于该模型的实验周期较短, 且具有高通量特性, ERG 已应用于幼虫斑马鱼的疾病模型功能评估、彩色视觉和视网膜发育分析、视觉生理节律研究等方面的应用。并检测药物^8,9,10,11,12。

然而, 目前的方法对幼虫斑马鱼 ERG 有一些复杂性, 这可能会使其更难采用。已发布的幼虫斑马鱼 erg 协议通常使用充满导电液体的玻璃微型移液器作为记录电极^3,4,5,^{13, 这}需要高质量的微型移液器提示³。制造微管拉拔器等专用设备, 在某些情况下还需要微型锻造设备。这对资源有限的实验室来说可能是一个挑战, 即使在适应现有的小动物 ERG 系统来测量幼虫斑马鱼视觉功能时, 也会导致额外的费用。即使平滑时, 锐利的微型移液器尖端也会损坏幼虫眼睛的表面。此外, 用于电生理的商用微型移液器支架是用固定的银线建造的。这些固定的电线在重复使用后变得钝化, 需要购买新的支架, 从而增加维护成本。

在这里, 我们描述了一种 erg 方法使用锥形海绵尖端记录电极, 这是特别有用的适应已建立的小动物 ERG 设置的幼虫斑马鱼 ERG 测量。该电极很容易使用普通的聚醋酸乙烯酯 (PVA) 海绵和细银丝, 无需任何其他专用设备。我们的数据表明, 这种新型电极具有足够的灵敏度和可靠性, 可以证明4至 7 dpf 之间的幼虫斑马神经回路的功能发展。这种经济实用的海绵尖电极可能有助于研究人员建立新的 ERG 系统或修改现有的小动物系统, 用于斑马鱼的研究。

Protocol

所有电子标志图 (ERG) 程序都是根据澳大利亚国家卫生和医学研究委员会动物护理和使用业务守则的规定进行的, 并得到了机构动物伦理委员会的批准。墨尔本大学。 1. 缓冲器准备 使用反渗透 (ro) 水制备10倍金鱼响铃的缓冲液 (1.25 Mm ncl、26 mm Kcl、25 mm ccl2、10 Mm Mgcl 2、100 mM 葡萄糖、100 mm hepes)。将缓冲液调整到 pH 7.8, 并使用0.22μm 过滤器对缓冲液进行灭菌…

Representative Results

本节提供了每天从4到 7 dpf 进行的 ERG 测量的代表性结果。从 4 dpf, ERG 反应显示鲁棒的 a 和 b 波成分, 这分别产生于光感受器和双极细胞。在每次测试时, b 波的振幅随光强的增加而增加 (图 2;图 3)。值得注意的是, 幼虫斑马鱼视网膜对变暗闪光的敏感性随着年龄的增长而增加。在强度低于-1.61 日志 cd. s m 2 的强度下, 在 4 dpf 时, a-o 和 b 波无?…

Discussion

在用于研究幼虫斑马鱼^{8、9、12、14}的工具套件中, erg 等功能读数变得越来越重要。由于幼虫斑马鱼眼体积小, 在大多数公布的协议 3^{、4、5、8、9中,}玻璃微管被改编为^{记录电极…}

Materials

0.22 µm filter	Millex GP	SLGP033RS	Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1-mL syringe	Terumo	DVR-5175	With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30G × ½" needle	Terumo	NN*3013R	For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier	ADInstruments	ML135	For amplifying ERG signals.
Bleach solution	King White	9333441000973	For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead	Grass Telefactor	F-E2-30	Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage	Photometric Solution International		For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl	Photometric Solution International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs	Phillips Light Co.		For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel	Microsoft	version 2010	Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel	GenTeal Gel	9319099315560	Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette	Copan	200C	Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML785	Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge	MeiCheLe	R-1675	For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution	Aaxis Pacific	13317002	For electroplating silver wire electrode.
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire)	A&E metal	0.3 mm	Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope	Leica	M80	Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine	Sigma-aldrich	E10521-50G	For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform	custom-made		For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings