تسجيل اليكتروريتينوجرام في "الزرد اليرقات" استخدام القطب نصيحة الأسفنج على شكل مخروط رواية A
Summary
نقدم هنا، بروتوكول أن يبسط قياس الاستجابات اليكتروريتينوجرام مقولة الخفيفة من الزرد اليرقات. يمكن أن تساعد مسرى رواية على شكل مخروط الأسفنج-تلميح جعل دراسة التنمية البصرية في الزرد اليرقات باستخدام اليكتروريتينوجرام أرج أسهل تحقيقا مع نتائج موثوق بها، وانخفاض التكلفة.
Abstract
الزرد (دانيو rerio) يستخدم عادة كنموذج فقاريات في الدراسات الإنمائية، وهو مناسبة خاصة لعلم الأعصاب البصرية. للقياسات الوظيفية للأداء البصري، اليكتروريتينوجرافي (ERG) هو أسلوب غير الغازية مثالية، التي ظلت راسخة في الأنواع الفقارية أعلى. يتزايد استخدام هذا النهج لدراسة الدالة البصرية في الزرد، بما في ذلك أثناء مرحلة اليرقات المبكر. بيد أن مسرى التسجيل الأكثر استخداماً لليرقات الزرد أرج حتى الآن هو مسرى ميكروبيبيتي الزجاج، الأمر الذي يتطلب معدات متخصصة لصناعتها، يقدم تحديا للمختبرات ذات الموارد المحدودة. نقدم هنا، بروتوكول أرج الزرد يرقات باستخدام قطب نصيحة الأسفنج على شكل مخروط. مسرى الرواية أسهل لتصنيع والتعامل، أكثر اقتصادا، وأقل احتمالاً لتلف العين اليرقات من ميكروبيبيتي الزجاج. مثل أساليب أرج المنشورة سابقا، يمكن تقييم البروتوكول الحالي وظيفة الشبكية الخارجي عن طريق مستقبله واستجابات الخلية القطبين،-وب-موجه، على التوالي. البروتوكول يمكن أن تبين بوضوح صقل الدالة البصرية في جميع أنحاء التطور المبكر لليرقات الزرد، تدعم الأداة المساعدة وحساسية، وموثوقية مسرى الرواية. قطب كهربائي تبسيط مفيد بشكل خاص عند إنشاء نظام جديد لارج أو تعديل جهاز أرج الحيوانات الصغيرة الموجودة لقياس الزرد، ومساعدة الباحثين في علوم الأعصاب البصرية استخدامها في الزرد نموذج الكائن.
Introduction
وقد أصبح الزرد (دانيو rerio) نموذج فقاريات وراثية مستخدمة على نطاق واسع، بما في ذلك الدراسات المتعلقة بعلوم الأعصاب البصرية. ازدياد شعبية من هذا النوع يمكن أن يعزى إلى المزايا بما في ذلك سهولة التلاعب بالجينات، عاليا يحافظ النظام المرئي الفقاريات (أنواع الخلايا العصبية ومورفولوجية تشريحية والمنظمة، وعلم الوراثة الكامنة)، وخصوبة عالية وانخفاض تكاليف تربية مقارنة بنماذج الثدييات1. اليكتروريتينوجرام غير الغازية (ERG) منذ فترة طويلة تستخدم سريرياً لتقييم دالة visual البشرية، وفي إنشاء مختبر التحديد الكمي للرؤية في مجموعة من الأنواع الكبيرة والصغيرة بما فيها القوارض واليرقات الزرد2،3 , 4 , 5-مكونات أرج تحليل الأكثر شيوعاً هي موجه والموجه ب، التي تنشأ من استشعار الضوء photoreceptors وإينتيرنيورونس بين القطبين، على التوالي. في الزرد اليرقات، تنشأ طبقات متميزة في الشبكية قبل 3 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) ومورفولوجية المخروط مستقبله المحطة الطرفية synapses ناضجة قبل6،إدارة الشرطة الاتحادية 47. وبالتالي إنشاء وظيفة الشبكية الخارجي من الزرد اليرقات قبل 4 إدارة الشرطة الاتحادية، مما يعني أن أرج قابل للقياس من هذا العمر المبكر فصاعدا. بسبب دورة تجريبية قصيرة وخصائص الطراز الفائق، طبق أرج على الزرد اليرقات للتقييم الوظيفي لنماذج المرض، وتحليل التنمية لون الرؤية والشبكية، ودراسة البصرية circadian إيقاعات واختبار المخدرات8،،من910،،من1112.
بيد أن النهج الحالي لليرقات الزرد أرج له بعض التعقيدات التي قد تجعل من الصعب على اعتماد. الزرد اليرقات المنشورة أرج البروتوكولات تستخدم بشكل شائع ميكروبيبيتي زجاج مليئة بسائل موصل كتسجيل القطب3،4،5،13، الأمر الذي يتطلب من ميكروبيبيتي عالية الجودة تلميح3. معدات متخصصة، مثل ساحبة ميكروبيبيتي، وفي بعض الحالات ميكروفورجي، مطلوبة من أجل تصنيعها. وهذا يمكن أن يشكل تحديا للمختبرات ذات الموارد المحدودة، ويؤدي إلى تكاليف إضافية حتى عند تكييف النظم أرج الحيوانات الصغيرة المتاحة لقياس دالة visual الزرد اليرقات. وحتى عندما ممهدة، نصيحة ميكروبيبيتي حادة يمكن أن تلحق الضرر سطح العين اليرقات. بالإضافة إلى ذلك، يتم بناء أصحاب ميكروبيبيتي التجارية للكهربية بسلك فضة ثابتة. تصبح هذه ثابتة أسلاك تخمل بعد الاستخدام المتكرر، التي تتطلب شراء أصحاب جديدة مما يؤدي إلى زيادة تكاليف الصيانة.
هنا يصف لنا أسلوب أرج استخدام قطب تسجيل نصيحة الأسفنج على شكل مخروط، التي مفيدة بشكل خاص لتكييف الأجهزة أرج الحيوانات الصغيرة المنشأة للقياسات أرج الزرد اليرقات. الكهربائي بسهولة باستخدام المشتركة اسيتات البولي فينيل (PVA) الأسفنج والأسلاك الفضية الجميلة دون أي معدات متخصصة أخرى. البيانات المتوفرة لدينا تظهر أن هذا القطب رواية حساسة ويمكن الاعتماد عليها ما يكفي لإثبات التنمية الوظيفية للدوائر العصبية الشبكية في الزرد اليرقات بين 4 و 7 في إدارة الشرطة الاتحادية. هذا القطب نصيحة الأسفنج اقتصادا والعملية قد تكون مفيدة للباحثين وضع نظم جديدة لارج أو تعديل النظم القائمة في الحيوانات الصغيرة، للدراسات الزرد.
Protocol
Representative Results
Discussion
قراءات فنية مثل أرج أصبحت متزايدة الأهمية في الجناح للأدوات المستخدمة في دراسة الزرد اليرقات8،9،،من1214. نظراً لصغر حجم العين الزرد اليرقات، تكيفت ميكروبيبيتيس الزجاج كتسجيل كهربائي في نشر معظم البروتوكولات3</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل لهذا المشروع قدمت بمنحه من معهد علم الأعصاب ملبورن (إلى PTG، PRJ و BVB).
Materials
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1-mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
- Roper, C., Tanguay, R. L., Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. . Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). , 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
- Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 57-68 (2002).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
- Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
- Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , (2018).
- Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
- Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
- Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).
