本文介绍了一种简化幼年斑马鱼光诱发视网膜电图（ERG）反应测量的实验方案。一种新型的圆锥形海绵尖电极有助于更简便地开展幼年斑马鱼视觉发育的视网膜电图研究，获得可靠的结果，同时降低实验成本。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼（Danio rerio）在发育研究中常被用作脊椎动物模型，尤其适用于视觉神经科学。对于视觉功能的检测，视网膜电图（ERG）是一种理想的非侵入性方法，该方法在高等脊椎动物中已有成熟应用。近年来，该技术也越来越多地用于检测斑马鱼的视觉功能，包括其早期发育的幼体阶段。然而，目前用于幼体斑马鱼ERG记录最常用的电极是玻璃微吸管电极，其制备需要专门设备，这对资源有限的实验室构成了挑战。本文介绍一种使用锥形海绵头电极的幼体斑马鱼ERG实验方案。这种新型电极更易于制备和操作，成本更低，且对幼体眼睛的损伤风险小于玻璃微吸管电极。与已发表的ERG方法类似，本方案可通过感光细胞和双极细胞的反应（即a波和b波）评估视网膜外层功能。该方案能够清晰展示斑马鱼幼体早期发育过程中视觉功能的逐步完善，验证了新型电极的实用性、灵敏性和可靠性。这种简化的电极在建立新的ERG系统或将现有的小型动物ERG装置改造用于斑马鱼检测时尤为有用，有助于视觉神经科学领域的研究人员更好地利用斑马鱼这一模式生物。
引言
斑马鱼（Danio rerio）已成为广泛使用的脊椎动物遗传学模型，被应用于视觉神经科学的研究。该物种日益受到青睐的原因在于其具有多种优势，包括易于进行遗传操作、视觉系统在脊椎动物中高度保守（神经元类型、解剖形态与结构组织以及基础遗传机制）、繁殖力高，且饲养成本较哺乳动物模型更低1。无创性视网膜电图（ERG）长期以来在临床上用于评估人类视觉功能，在实验室环境中则用于量化多种大小物种的视觉功能，包括啮齿类动物和斑马鱼幼体2,3,4,5。最常分析的ERG成分是a波和b波，分别起源于感光光感受器细胞和双极中间神经元。在斑马鱼幼体中，视网膜的分层结构在受精后3天（dpf）即已形成，光感受器视锥细胞终末突触的形态在4 dpf前已发育成熟6,7。因此，斑马鱼幼体的外层视网膜功能在4 dpf前即已建立，意味着从这一早期阶段起即可记录到ERG信号。由于实验周期短且模型具有高通量特性，ERG已被应用于斑马鱼幼体，用于疾病模型的功能评估、色觉与视网膜发育分析、视觉昼夜节律研究以及药物测试
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方案
所有视网膜电图（ERG）操作均按照澳大利亚国家卫生与医学研究委员会关于动物护理与使用的实践准则进行，并已获得墨尔本大学机构动物伦理委员会的批准。
1. 缓冲液的配制
- 使用反渗透（RO）水配制10倍浓度的金鱼林格氏液（1.25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM 葡萄糖, 100 mM HEPES）。将缓冲液pH值调节至7.8，并使用0.22 μm滤膜过滤除菌。将10倍浓度的缓冲液作为储备液于4 °C保存3。
注意：10倍浓度林格氏液应在3个月内使用完毕。 - 实验当天，使用反渗透水将10倍浓度金鱼林格氏液稀释为1倍浓度。
注意：1倍浓度金鱼林格氏液用于浸润PVA海绵，包括用于放置斑马鱼幼体的海绵以及记录电极尖端上的海绵。
2. 电极制备
- 准备锥形海绵记录电极。
- 使用手术刀片从铂电极引线延长线的雄性端切下，并小心去除末端10 mm的外层聚四氟乙烯绝缘涂层，注意不要损坏电极引线的内部金属丝。
- 剪取一段40 mm长的银丝....
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结果
本部分提供了从4至7 dpf每日记录的ERG测量代表性结果。自4 dpf起，ERG反应显示出明显的a波和b波成分，分别来源于光感受器和双极细胞。在每个检测年龄阶段，b波的振幅均随光强度的增加而增大（图2；图3）。值得注意的是，幼年斑马鱼视网膜对较弱闪光的敏感性随年龄增长而提高。在4 dpf时，当刺激强度低于-1.61 log cd·s/m2时，a波和b波均无法识别，而在相同强度下，较年长的幼鱼则可检测到清晰的信号（图2）。b波反应在4至5 dpf之间显著增强（P < 0.0001；图2A-B；图3B）。尽管在5至7 dpf期间低强度刺激下的b波变化较小，但在2.48 log cd·s/m2强度下，7 d.......
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讨论
诸如视网膜电图（ERG）等功能性检测指标，在研究幼年斑马鱼的工具组合中正变得越来越重要8,9,12,14。由于幼年斑马鱼眼睛体积较小，大多数已发表的实验方案均采用玻璃微电极作为记录电极3,4,5,8,9,12,13,14。本文描述了一种使用更简单的锥形海绵.......
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披露
作者无与本工作相关的披露信息。
致谢
本项目由墨尔本神经科学研究所资助（资助号：PTG，PRJ） & BVB)
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 滤膜 | Millex GP | SLGP033RS | 用于过滤 10× 金鱼林格氏液，以实现灭菌 |
| 1 mL 注射器 | Terumo | DVR-5175 | 配备 30G × ½" 针头，用于向电极海绵尖端滴加生理盐水，防止干燥及视网膜电图（ERG）信号噪声增加 |
| 30 G × ½" 针头 | Terumo | NN*3013R | 用于向海绵尖端电极添加生理盐水 |
| 生物放大器 | ADInstruments | ML135 | 用于放大视网膜电图（ERG）信号 |
| 次氯酸钠漂白液 | King White | 9333441000973 | 用于银电极氯化的替代方法；活性成分为 42 g/L 次氯酸钠 |
| 循环水浴锅 | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | 用于制作水浴加热平台 |
| 电极导线 | Grass Telefactor | F-E2-30 | 铂金电缆，用于连接银丝电极与放大器 |
| 法拉第笼 | Photometric Solution International | 用于维持暗适应状态，并包裹全视野刺激装置（Ganzfeld setup），以提高信噪比 | |
| 全视野刺激碗（Ganzfeld Bowl） | Photometric Solution International | 定制设计的光刺激器：直径 36 mm，孔径 13 cm | |
| Luxeon 发光二极管（LED） | Phillips Light Co. | 用于光刺激，包含二十个 5W 和一个 1W 的 LED | |
| 显微操作器 | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | 在实验过程中固定记录电极 |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | 用于数据分析的电子表格软件 |
| 保湿眼用凝胶 | GenTeal Gel | 9319099315560 | 用于在记录期间覆盖斑马鱼幼体，防止脱水；活性成分为 0.3% 羟丙基甲基纤维素和 0.22% 卡波姆 980 |
| 巴斯德移液管 | Copan | 200C | 用于小心转移斑马鱼幼体 |
| Powerlab 数据采集系统 | ADInstruments | ML785 | 控制 LED 以产生刺激信号 |
| 聚乙烯醇（PVA）海绵 | MeiCheLe | R-1675 | 用于放置斑马鱼幼体，并制作锥形电极尖端 |
| 生理盐水溶液 | Aaxis Pacific | 13317002 | 用于银丝电极的电镀 |
| Scope 软件 | ADInstruments | version 3.7.6 | 通过 Powerlab 系统同步触发刺激并采集数据 |
| 银丝（细圆线） | A&E metal | 0.3 mm | 用于制作记录电极和参考电极 |
| 体视显微镜 | Leica | M80 | 用于塑形并测量锥形海绵尖端（目镜带标尺）；置于法拉第笼内，用于电极定位 |
| 三卡因（Tricaine） | Sigma-aldrich | E10521-50G | 用于麻醉斑马鱼幼体 |
| 水浴加热平台 | 定制 | 用于在视网膜电图（ERG）记录期间维持海绵平台及幼体体温 |
参考文献
- Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. , Academic Press. 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials ....
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重印与许可
