Electroretinogram opname in larvale Zebrafish met behulp van A roman kegel-vormig spons-tip elektrode

Summary

Hier presenteren we een protocol dat de meting van lichte evoked electroretinogram reacties van larvale zebrafish vereenvoudigt. Een roman kegelvormige spons-tip-elektrode kan helpen om de studie van visuele ontwikkeling in larvale zebrafish met behulp van de electroretinogram ERG gemakkelijker te bereiken met betrouwbare resultaten en lagere kosten.

Abstract

De zebravissen (Danio rerio) wordt vaak gebruikt als een gewervelde model in developmental studies en is bijzonder geschikt voor visuele neurowetenschappen. Voor functionele metingen van visuele prestaties is electroretinography (ERG) een ideale niet-invasieve methode, die goed ingeburgerd in hogere gewervelde dieren is. Deze aanpak wordt steeds vaker gebruikt voor de behandeling van de visuele functie in zebrafish, met inbegrip van tijdens de vroege developmental larvale stadia. De meest gebruikte opname-elektrode voor larvale zebrafish ERG tot op heden is echter de glazen micropipet-elektrode, die gespecialiseerde apparatuur voor de productie vereist, het presenteren van een uitdaging voor laboratoria met beperkte middelen. Hier presenteren we een larvale zebrafish ERG protocol met behulp van een elektrode kegelvormige spons-tip. De roman elektrode is gemakkelijker te vervaardigen en handvat, zuiniger, en minder kans op schade van het larvale oog dan de glazen micropipet. Zoals eerder gepubliceerde ERG methoden, kan het huidige protocol buitenste retinale functie via fotoreceptor en de antwoorden van de bipolaire cel, de a – en b-Golf, respectievelijk beoordelen. Het protocol kan illustreren de verfijning van de visuele functie gedurende de vroege ontwikkeling van het larven van de zebravis, ter ondersteuning van het hulpprogramma, gevoeligheid en betrouwbaarheid van de roman elektrode. De vereenvoudigde elektrode is vooral handig wanneer tot oprichting van een nieuw systeem van de ERG of het wijzigen van bestaande kleine-dier ERG apparaat voor meting van de zebravis, medeplichtigheid aan onderzoekers in de visuele neurowetenschappen te gebruiken van de zebravis model organisme.

Introduction

De zebravissen (Danio rerio) is een veel gebruikte genetische gewervelde model, met inbegrip van studies van de visuele neurowetenschappen geworden. De toenemende populariteit van deze soort kan worden toegeschreven aan voordelen waaronder gemak van genetische manipulatie, de zeer geconserveerde gewervelde visuele systeem (neuron typen, anatomische morfologie en organisatie en onderliggende genetica), de hoge vruchtbaarheid en lagere kosten van de veehouderij in vergelijking met zoogdieren modellen¹. De niet-invasieve electroretinogram (ERG) heeft al lange tijd gebruikt klinisch te beoordelen van menselijke visuele functie, en in het laboratorium-omgeving te kwantificeren visie op een aantal grote en kleine soorten waaronder knaagdieren en larvale zebrafish^{2,3 , 4 , 5}. de meest voorkomende geanalyseerde ERG componenten zijn de a-Golf en b-Golf, afkomstig uit de researchdieren licht-sensing en bipolaire interneuronen, respectievelijk. In larvale zebrafish, verschillende lagen in de retina zijn opgericht door 3 dagen na bevruchting (dpf) en de morfologie van de fotoreceptor kegel terminal synapses volwassen vóór 4 dpf^6,7. Buitenste retinale functie van larvale zebrafish wordt aldus vastgesteld vóór 4 dpf, wat betekent dat de ERG meetbare vanaf deze jonge leeftijd vanaf is. Vanwege de korte experimentele cyclus en de eigenschappen van de hoog-productie van het model, heeft de ERG vereffend larvale zebrafish voor functionele beoordeling van ziekte modellen, kleur visie en retinale ontwikkeling analyseren, bestuderen van visuele circadiane ritmen en^8,9,10,11,12testen van drugs.

Huidige benaderingen voor larvale zebrafish ERG heeft echter enkele complexiteiten die kunnen maken het moeilijker om te nemen. Gepubliceerde larvale zebrafish ERG protocollen gebruiken meestal een glas micropipet gevuld met geleidende vloeistof als de opname elektrode^3,4,5,13, waarvoor een micropipet van hoge kwaliteit Tip³. Gespecialiseerde apparatuur, zoals een micropipet trekker en in sommige gevallen een microforge, zijn vereist voor de fabricage ervan. Dit kan een uitdaging voor laboratoria met beperkte middelen en leidt tot extra kosten, zelfs bij de aanpassing van de beschikbare kleine dierlijke ERG systemen voor het meten van de visuele functie larvale zebrafish. Zelfs wanneer gladgestreken, kan de scherpe micropipet tip schade aan het oppervlak van de larvale oog. Bovendien, worden commerciële micropipet houders voor electrofysiologie geconstrueerd met een vaste zilveren draad. Deze vaste draden worden gepassiveerd na herhaald gebruik, waarbij de aankoop van nieuwe houders leidt tot hogere onderhoudskosten.

Hier beschrijven we een ERG-methode met behulp van een kegelvormige spons-tip opname-elektrode, dat is met name handig voor de aanpassing van de gevestigde kleine-dier ERG setups voor larvale zebrafish ERG metingen. De elektrode wordt gemakkelijk gemaakt met behulp van gemeenschappelijke polyvinylacetaat (PVA) spons en fijn zilver draad zonder andere gespecialiseerde apparatuur. Onze gegevens blijkt dat deze roman elektrode is gevoelig en betrouwbaar genoeg is om aan te tonen van de functionele ontwikkeling van retinale neurale circuits in larvale zebrafish tussen 4 en 7 dpf. Deze economische en praktische spons-tip-elektrode kan nuttig zijn voor onderzoekers tot de oprichting van nieuwe ERG systemen of het wijzigen van bestaande systemen van de kleine dieren, voor zebrafish studies.

Protocol

Alle electroretinogram (ERG) procedures werden uitgevoerd volgens de bepalingen van de Australische nationale gezondheids- en medische Onderzoeksraad gedragscode voor de verzorging en het gebruik van dieren en goedgekeurd door het Comité van de institutionele dierenethiek op de Universiteit van Melbourne. 1. buffer voorbereiding Voorbereiden van de 10 x goudvis Ringer’s buffer (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, glucose 100 mM, 100 mM HEPES) met …

Representative Results

Deze sectie bevat representatieve resultaten voor ERG metingen dagelijks van 4 tot 7 dpf. Vanaf 4 dpf Toon ERG reacties robuuste componenten van de a – en b-Golf, die uit researchdieren en bipolaire cellen, respectievelijk voortvloeien. Op elke leeftijd getest, de amplitude van het b-wave verhoogd met lichte intensiteit (Figuur 2; Figuur 3). Met name de gevoeligheid van het netvlies van de larvale zebrafish aan dimmer flitsen verhoogd met de …

Discussion

Functionele uitlezingen zoals de ERG zijn steeds belangrijker in de suite van tools gebruikt bij het bestuderen van larvale zebrafish^8,,^9,,^12,14geworden. Als gevolg van de geringe omvang van het larvale zebrafish oog, zijn glas micropipetten aangepast als de opname van elektroden in de meest gepubliceerde protocollen^3,4,<sup …

Materials

0.22 µm filter	Millex GP	SLGP033RS	Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1-mL syringe	Terumo	DVR-5175	With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30G × ½" needle	Terumo	NN*3013R	For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier	ADInstruments	ML135	For amplifying ERG signals.
Bleach solution	King White	9333441000973	For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead	Grass Telefactor	F-E2-30	Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage	Photometric Solution International		For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl	Photometric Solution International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs	Phillips Light Co.		For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel	Microsoft	version 2010	Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel	GenTeal Gel	9319099315560	Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette	Copan	200C	Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML785	Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge	MeiCheLe	R-1675	For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution	Aaxis Pacific	13317002	For electroplating silver wire electrode.
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire)	A&E metal	0.3 mm	Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope	Leica	M80	Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine	Sigma-aldrich	E10521-50G	For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform	custom-made		For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings